Métodos y composiciones para modular la contractilidad cardiaca.

Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que reprime la transcripción de un gen de fosfolamban, donde el polipéptido comprende:

(i) un dominio de unión a ADN de dedo de cinc que está diseñado para unirse a un sitio diana en el gen fosfolamban; y

(ii) un dominio de represión de la transcripción;

donde el ácido nucleico puede expresarse en una o más células de un sujeto a tratar,

donde el dominio de unión a ADN de dedo de cinc comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc se selecciona del grupo que consiste en: (i)

F1: RSDHLSQ (SEC ID N º38)

F2: RSDVRKN (SEC ID Nº 39)

F3: RSDALSV (SEC ID Nº 40)

F4: DNANRTK (SEC ID Nº 41)

F5: RSDHLST (SEC ID Nº 42)

F6: TSSNRTK (SEC ID Nº 43), y

(ii)

F1: RSDNLSE (SEC ID Nº 44)

F2: HSRSRKT (SEC ID Nº 45)

F3: DSESLNA (SEC ID Nº 46)

F4: TSSNLSR (SEC ID Nº 47)

F5: RSDNLSQ (SEC ID Nº 48)

F6: QRQHRKT (SEC ID Nº 49).

Métodos y composiciones para modular la contractilidad cardiaca Antecedentes

La insuficiencia cardiaca afecta a más de dos millones de estadounidenses, y la insuficiencia cardíaca congestiva se reconoce como la causa más común de hospitalización y mortalidad en la sociedad occidental. La insuficiencia cardíaca congestiva es un síndrome caracterizado por la disfunción ventricular izquierda, tolerancia al ejercicio reducida, deterioro de la calidad de vida y la esperanza de vida acortada dramáticamente. Disminución de la contractilidad del ventrículo izquierdo conduce a la reducción del gasto cardiaco con la consiguiente arterial slstémlca y la vasoconstricción venosa.

La contractilidad parece estar regulada principalmente por el flujo de calcio. Para que el corazón se contraiga, el calcio debe ser liberado en el cuerpo principal (sarcoplasma) de las células cardíacas. Cuanto más calcio entra, más fuerte es la fuerza de contracción. Cuando el corazón se relaja, el calcio se bombea hacia fuera del sarcoplasma en el retículo sarcoplásmico (SR). Por lo tanto, el músculo cardíaco se activa para contraerse y relajarse por un mecanismo donde el calcio (Ca2+) se libera desde un depósito en la célula muscular, o miocito, y luego se bombea rápidamente de vuelta al depósito, llamado retículo sarcoplásmico (SR) por la Ca2+'ATPasa 2a del retículo sarco(endo)plásmico (SERCA2a).

La eficiencia con la que Ca2+ se devuelve al SR determina la cantidad de Ca 2+ que está disponible para la siguiente contracción. El fosfolamban(PLN) es una fosfoproteína de regulación que modula el transporte activo de Ca2+por el cardiaca reticular sarcoplásmico Ca (2 +) - ATPasa de la enzima (SERCA2) en el lumen del retículo sarcoplásmico. El fosfolamban, que es un inhibidor reversible de SERCA2, reprime la actividad de la enzima, y esta inhibición se alivia después de la fosforilación de PLN en respuesta a la estimulación (3-adrenérgica.

La relación de fosfolamban a SERCA2 parece ser crítica en la regulación de la contractilidad miocárdica, y las alteraciones en esta relación pueden contribuir al deterioro funcional observada durante la insuficiencia cardíaca. (.. Koss et al (1997) básico Res Cardiol 1997; 92 Suppl 1: 17-24). En particular, una relación de SERCA2a / PLN disminuido, lo que se observa comúnmente en la insuficiencia cardíaca, conduce a la reducción SR Ca 2+ reserva y se debilitó la contractilidad. La Importancia de la SERCA2a: PLN relación a la contractilidad también ha sido examinado utilizando ratones defectivos en PLN; modelos murlnos con insuficiencia cardiaca (por ejemplo, los modelos que sobreexpresan SERCA2a, así como en los cardlomlocltos humanos aislados (por ejemplo, la inhibición mediada por antisentido PLN en los mlocltos que sobreexpresan SERCA2a). Véase, por ejemplo, MacLennan et al. (23) Nat Rev Mol CelIBiol. 4 (7): 566-77; Elzema et al (2) Circulación 11 (18):. 2193-9; del Monte et al (22) Circulación 15 (8): 94-7; Mlnamlsawa et al (1999) Cell 99 (3):. 313-22.

Sin embargo, la modulación de la expresión de PLN para modular la contractilidad cardiaca no se ha descrito previamente Además, la capacidad de alterar la contractilidad cardíaca mediante la modulación de la expresión PLN puede tener utilidad en el tratamiento y / o prevención. Insuficiencia cardíaca congestiva y / o otras enfermedades cardiacas.

Zhang et al. (Molecular Therapy Volume 9, Supplement 1, May 24) divulga que las proteínas dedo de cinc pueden estar dirigidas al promotor humano o de rata de fosfolamban. No se ha divulgado una secuencia diana específica de tales proteínas dedo de cinc. Federica del Monte (Clrculatlon 22; 15:94-97) divulga células mlocárdlcas que fueron Infectadas con adenovirus que codifican una molécula antisentldo de fosfolamban. El documento WO 2/57293 divulga la modulación de la expresión génlca por proteínas de dedos de cinc no canónicas.

El documento US 23/5259 A1 divulga ácidos nucleicos enzimáticos para la modulación de la expresión de dianas moleculares.

Jamieson et al. (Nature Reviews, Drug Discovery, Volume 2, p. 361-368, May 23) analizan las proteínas dedo de cinc como plataforma tecnológica en el descubrimiento de medicamentos y terapéuticas.

Resumen

Una variedad de proteínas con dedos de cinc (ZFP) y métodos que utilizan tales proteínas se proporcionan para su uso en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca. En particular, se describen ZFP que se unen a un sitio diana en un gen fosfolamban (PLN). Las ZFP pueden fusionarse con un dominio regulador como parte de una proteína de fusión. Al seleccionar ya sea un dominio de activación o un dominio de represión para la fusión con la ZFP, se puede activar o reprimirla expresión de genes. Por lo tanto, mediante la elección apropiada del dominio regulador fusionado a la ZFP, se puede modular selectivamente la expresión de PLN, y por lo tanto controlar vahos procesos fisiológicos correlacionados con la contractilidad y calcio compartlmentaclón.

Mediante ingeniería de los ZFP que se unen a (y modular la expresión de) a PLN diversos grados, el grado en que un proceso fisiológico (por ejemplo, la contractilidad) es modulada se puede variar, permitiendo de este modo de tratamiento para ser adaptado. Esto se puede lograr debido a múltiples sitios diana (por ejemplo, sitios de 9, 12 o 18

pares de bases diana) en el gen PLN, o de hecho en cualquier gen Implicado en la contractilidad o calcio compartimentación, puede ser adoptada por las ZFP proporcionados en el presente documento. Así, en algunos métodos, se administra una pluralidad de ZFP (o fusiones que comprenden estos ZFP). Estos ZFP pueden entonces unirse a diferentes sitios de destino situados en o alrededor del gen PLN. Tales ZFP pueden en algunos casos tener un efecto sinérgico. En ciertos métodos, la pluralidad de proteínas de fusión incluye diferentes dominios reguladores.

También se proporcionan en el presente documento polinucleótidos y ácidos nucleicos que codifican las ZFP divulgadas en el presente documento. Además, también se proporcionan composiciones farmacéuticas que contienen los ácidos y / o ZFP nucleicos. Por ejemplo, ciertas composiciones Incluyen un ácido nucleico que codifica una de las ZFP descritos en el presente documento unido operativamente a una secuencia reguladora, en combinación con un vehículo o dlluyente farmacéuticamente aceptable, donde la secuencia reguladora permite la expresión del ácido nucleico en una célula. Composiciones a base de proteínas Incluyen una ZFP como se describe en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable o diluyente.

Estas y otras realizaciones se les ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica en vista de la presente descripción.

La presente invención se describe en las reivindicaciones 1-1.

Breve descripción de los dibujos

FIG. 1, los paneles A y B, muestran las secuencias de aminoácidos de las proteínas de fusión que comprenden ZFP ejemplares como se describe en el presente documento que reprimen la expresión de PLN. FIG. 1 A muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende la ZFP designado SBS-6439 (SEC ID N° 68). FIG. 1B muestra la secuencia de aminoácidos de una proteína de fusión que comprende la ZFP SBS-6576 designado (SEC ID N° 69).

FIG. 2, los paneles AC, son gráficos que representan la represión de fosfolamban (PLN) expresión en células de rata transfectadas con vectores plasmídicos o de AAV que contienen una ZFP específica PLN. FIG. 2A muestra la represión del PLN por plásmidos que codifican proteínas de fusión que comprenden un dominio de represión KOX y ZFP orientada PLN (SBS-6435, SBS-6437 o SBS-6439). Las proteínas de fusión se designan 6435-KOX, SBS-6437-KOX o 6439-KOX. FIG. 2B muestra la represión de PLN por plásmidos que codifican 6439-KOX en las células no seleccionadas y las células sometidas a la selección de puromiclna. FIG. 2C representa la represión de rata cuando PLN 6439-KOX se administra usando vectores plásmidos o AAV.

FIG. 3, paneles AD, son gráficos que representan la represión de fosfolamban (PLN) la expresión en células humanas transfectadas con plásmidos que contienen una ZFP específica PLN. FIG. 3 A representa represión de la expresión en las células PLN UtSMC por 6576-KOX en comparación con un control plásmldo vacío. FIG. 3B representa represión de la expresión en las células PLN JRH3 por 6576-KOX en comparación con un control plásmldo vacío. FIG. 3C representa represión de la expresión en las células PLN UtSMC por 6576-KOX y 6624- KOX en comparación con un control plásmldo vacío. FIG. 3D representa represión de la expresión en las células PLN SJRH3 por 6576-KOX... [Seguir leyendo]

1. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico, donde el ácido nucleico codifica un polipéptido que reprime la transcripción de un gen de fosfolamban, donde el polipéptido comprende:

(i) un dominio de unión a ADN de dedo de cinc que está diseñado para unirse a un sitio diana en el gen fosfolamban; y

(ii) un dominio de represión de la transcripción;

donde el ácido nucleico puede expresarse en una o más células de un sujeto a tratar,

donde el dominio de unión a ADN de dedo de cinc comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc se selecciona del grupo que consiste en:

(¡)

F1: RSDHLSQ (SEC ID N °38)

F2: RSDVRKN (SEC ID N° 39)

F3: RSDALSV (SEC ID N° 4)

F4: DNANRTK (SEC ID N° 41)

F5: RSDHLST (SEC ID N° 42)

F6: TSSNRTK (SEC ID N° 43), y

(¡i)

F1: RSDNLSE (SEC ID N°44)

F2: HSRSRKT (SEC ID N° 45)

F3: DSESLNA (SEC ID N° 46)

F4: TSSNLSR (SEC ID N° 47)

F5: RSDNLSQ (SEC ID N° 48)

F6: QRQHRKT (SEC ID N° 49).

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 para su uso en la modulación de la contractilidad cardiaca en un sujeto.

3. Un polinucleótido que codifica una protema que comprende un dominio de dedos de cinc modificado de unión al ADN, donde el dominio de unión a ADN comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc es la siguiente:

F1: RSDHLSQ (SEC ID N° 38)

F2: RSDVRKN (SEC ID N° 39)

F3: RSDALSV (SEC ID N° 4)

F4: DNANRTK (SEC ID N° 41)

F5: RSDHLST (SEC ID N° 42)

F6: TSSNRTK (SEC ID N° 43).

4. Un polinucleótido que codifica una proteína que comprende un dominio de dedos de cinc modificado de unión al ADN, donde el dominio de unión a ADN comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc es la siguiente:

F1: RSDNLSE (SEC ID N° 44)

F2: HSRSRKT (SEC ID N°45)

F3: DSESLNA (SEC ID N° 46)

F4: TSSNLSR (SEC ID N° 47)

F5: RSDNLSQ (SEC ID N°48)

F6: QRQHRKT (SEC ID N° 49).

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde el dominio de represión transcripcional es un dominio KOX.

6. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido, donde el polipéptido comprende:

(i) un dominio de unión a ADN de dedo de cinc que está diseñado para unirse a un sitio diana en el gen fosfolamban; y

(ii) un dominio de represión de la transcripción;

mediante el cual el polipéptido es capaz de unirse al sitio diana y reprimir la transcripción del gen fosfolamban, donde el dominio de dedos de cinc de unión al ADN comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc se selecciona del grupo que consiste en:

F1: RSDHLSQ (SEC ID N° 38)

F2: RSDVRKN (SEC ID N° 39)

F3: RSDALSV (SEC ID N° 4)

F4: DNANRTK (SEC ID N°41)

F5: RSDHLST (SEC ID N° 42)

F6: TSSNRTK (SEC ID N° 43), y

(ü)

F1: RSDNLSE (SEC ID N°44)

F2: HSRSRKT (SEC ID N° 45)

F3: DSESLNA (SEC ID N° 46)

F4: TSSNLSR (SEC ID N° 47)

F5: RSDNLSQ (SEC ID N° 48)

F6: QRQHRKT (SEC ID N° 49).

7. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 6 para su uso en la modulación de la contractilidad cardiaca en un sujeto.

8. Una proteína que comprende un dominio de dedos de cinc modificado de unión al ADN, donde el dominio de unión a ADN comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc es la siguiente:

F1: RSDHLSQ (SEC ID N° 38) F2: RSDVRKN (SEC ID N° 39) F3: RSDALSV (SEC ID N° 4) F4: DNANRTK (SEC ID N° 41) F5: RSDHLST (SEC ID N° 42) F6: TSSNRTK (SEC ID N° 43).

9. Una proteína que comprende un dominio de dedos de cinc modificado de unión al ADN, donde el dominio de unión a ADN comprende seis dedos de cinc y la secuencia de aminoácidos de las regiones de reconocimiento de los dedos de cinc es la siguiente:

F1: RSDNLSE (SEC ID N° 44)

F2: HSRSRKT (SEC ID N° 45)

F3: DSESLNA (SEC ID N° 46)

F4: TSSNLSR (SEC ID N° 47)

F5: RSDNLSQ (SEC ID N° 48)

F6: QRQHRKT (SEC ID N° 49).

1. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 7, donde el dominio de represión transcripcional es un dominio KOX.