Métodos y composiciones para la escisión y recombinación dirigidas.

Un método para escindir cromatina celular en una región de interés,

comprendiendo el método:

(a) seleccionar la región de interés;

(b) manipular un primer dominio de unión de dedos de cinc para unirse a una primera secuencia de nucleótidos en la región de interés;

(c) proporcionar un segundo dominio de unión de dedos de cinc que se une a una segunda secuencia de nucleótidos en la región de interés, en el que la segunda secuencia se localiza entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia;

(d) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión el primer dominio de unión de dedos de cinc y un primer medio dominio de escisión; y

(e) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión el segundo dominio de unión de dedos de cinc y un segundo medio dominio de escisión;

en el que

(i) la primera proteína de fusión se une a la primera secuencia de nucleótidos,

(ii) la segunda proteína de fusión se une a la segunda secuencia de nucleótidos,

(iii) dicha unión de la primera y segunda proteínas de fusión posiciona los medios dominios de escisión de forma que la cromatina celular se escinda en la región de interés, y

iv) en al menos una de la primera o segunda proteínas de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2005/003245.

Solicitante: SANGAMO BIOSCIENCES, INC..

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: POINT RICHMOND TECH CENTER, SUITE A100, 501 CANAL BOULEVARD RICHMOND, CA 94804 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: ZHANG,LEI, MILLER,JEFFREY C.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/435 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de animales; de humanos.
  • C07K14/47 C07K 14/00 […] › de mamíferos.
  • C07K14/715 C07K 14/00 […] › para citoquinas; para linfoquinas; para interferones.
  • C12N15/62 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Secuencias de ADN que codifican proteínas de fusión.
  • C12N15/85 C12N 15/00 […] › para células animales.
  • C12N9/14 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Hidrolasas (3.).
  • C12N9/22 C12N 9/00 […] › Ribonucleasas.

PDF original: ES-2543409_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Métodos y composiciones para la escisión y recombinación dirigidas Descripción

CAMPO TÉCNICO

La presente divulgación está en los campos de la ingeniería del genoma, mutagénesis y recombinación homóloga dirigidas.

ANTECEDENTES

Un área importante de interés en la biología del genoma, especialmente en vista de la determinación de las secuencias de nucleótidos completas de varios genomas, es la alteración dirigida de secuencias del genoma. Pero para proporcionar un ejemplo, la anemia drepanocítica se produce por mutación de un único par de nucleótidos en el gen humano -globina. Así, la capacidad para convertir la copia genómica endógena de este par de nucleótidos mutante en la secuencia no mutante en un forma estable y producir -globina normal proporcionaría una cura para la anemia drepanocítica.

Se han hecho intentos por alterar secuencias genómicas en células cultivadas aprovechando el fenómeno natural de la recombinación homóloga. Véanse, por ejemplo, Capecchi (1989) Science 244:1288-1292; patentes de EE.UU. nº

6.528.313 y 6.528.314. Si un polinucleótido tiene homología suficiente con la región genómica que contiene la secuencia que va a alterarse, es posible que parte o toda la secuencia del polinucleótido sustituya la secuencia genómica por recombinación homóloga. Sin embargo, la frecuencia de recombinación homóloga bajo estas circunstancias es extremadamente baja. Además, la frecuencia de inserción del polinucleótido exógeno en localizaciones genómicas que carecen de homología de secuencias supera la frecuencia de recombinación homóloga en varios órdenes de magnitud.

Se ha mostrado que la introducción de una rotura bicatenaria en ADN genómico, en la región del genoma que lleva homología con un polinucleótido exógeno, estimula la recombinación homóloga en este sitio por varios cientos de veces en células cultivadas. Rouet et al., (1994) Mol. Cell. Biol. 14:8096-8106; Choulika et al., (1995) Mol. Cell. Biol. 15:1968-1973; Donoho et at. (1998) Mol. Cell. Biol. 18:4070-4078. Véase también Johnson et al., (2001) Biochem. Soc. Trans. 29:196-201; y Yanez et al., (1998) Gene Therapy 5:149-159. En estos métodos, la escisión de ADN en la región genómica deseada se llevó a cabo insertando un sitio de reconocimiento para una meganucleasa (es decir, una endonucleasa cuya secuencia de reconocimiento es tan grande que no se produce, o se produce solo raramente, en el genoma de interés) en la región genómica deseada.

Sin embargo, la recombinación homóloga estimulada por la escisión de meganucleasas se basa en tanto la presencia fortuita de, como la inserción dirigida de, un sitio de reconocimiento de meganucleasa adecuado en la proximidad de la región genómica que va a alterarse. Como los sitios de reconocimiento de meganucleasa son raros (o inexistentes) en un genoma de mamífero típico, y la inserción de un sitio de reconocimiento de meganucleasa adecuado está plagado de las mismas dificultades que se han asociado a otras alteraciones genómicas, estos métodos no son ampliamente aplicables.

Bibikova et al., (Genetics 2002, 161:1169-1175) desvelan la escisión cromosómica dirigida y mutagénesis en Drosophila usando nucleasas de dedos de cinc, en el que un dominio de escisión está localizado en el extremo C con respecto a un dominio de dedos de cinc.

Así, sigue existiendo la necesidad de composiciones y métodos para la alteración dirigida de secuencias en cualquier genoma.

RESUMEN

La presente invención se define por las reivindicaciones.

La presente divulgación proporciona composiciones y métodos para la escisión dirigida de cromatina celular en una región de interés y/o recombinación homóloga en una región predeterminada de interés en células. Las células incluyen células cultivadas, células en un organismo y células que se han eliminado de un organismo para el tratamiento en casos en los que las células y/o sus descendientes se devolverán al organismo después del tratamiento. Una región de interés en cromatina celular puede ser, por ejemplo, una secuencia genómica o porción de la misma. Las composiciones incluyen polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de cinc manipulado (por ejemplo, un dominio de unión de dedos de cinc que tiene una especificidad novedosa) y un dominio de escisión, y polipéptidos de fusión que comprenden un dominio de unión de dedos de cinc manipulado y un medio dominio de escisión. Los dominios de escisión y medios dominios de escisión pueden obtenerse, por ejemplo, de diversas endonucleasas de restricción y/o endonucleasas de asentamiento.

La cromatina celular puede estar presente en cualquier tipo de célula que incluye, pero no se limita a, células

procariotas y eucariotas, células fúngicas, células vegetales, células de animales, células de mamífero, células de primate y células humanas. La cromatina celular puede estar presente, por ejemplo, en cromosomas o en genomas intracelulares de bacterias o virus infectantes.

En un aspecto, se proporciona un método para la escisión de cromatina celular en una región de interés (por ejemplo, un método para la escisión dirigida de secuencias genómicas) , comprendiendo el método (a) seleccionar la región de interés; (b) manipular un primer dominio de unión de dedos de cinc para unirse a una primera secuencia de nucleótidos en la región de interés; (c) proporcionar un segundo dominio de unión de dedos de cinc que se une a una segunda secuencia de nucleótidos en la región de interés, en el que la segunda secuencia se localiza entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia; (d) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión el primer dominio de unión de dedos de cinc y un primer medio dominio de escisión; y (e) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión el segundo dominio de unión de dedos de cinc y un segundo medio dominio de escisión; en el que la primera proteína de fusión se une a la primera secuencia de nucleótidos y la segunda proteína de fusión se une a la segunda secuencia de nucleótidos, y adicionalmente en el que dicha unión posiciona los medios dominios de escisión de forma que la cromatina celular se escinda en la región de interés. La escisión puede producirse entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos y, en ciertas realizaciones, el segundo dominio de unión de dedos de cinc se manipula para unirse a la segunda secuencia de nucleótidos.

Los medios dominios de escisión en la primera y segunda proteínas de fusión pueden ser de la misma endonucleasa o de endonucleasas diferentes. En ciertas realizaciones, la endonucleasa es una endonucleasa de restricción de tipo IIS. En realizaciones adicionales, la endonucleasa de restricción de tipo IIS es Fok I.

La polaridad de las proteínas de fusión puede ser de forma que el dominio de unión de dedos de cinc esté en el extremo N con respecto al medio dominio de escisión; alternativamente, el medio dominio de escisión puede estar en el extremo N con respecto al dominio de unión de dedos de cinc. Cuando se usan dos proteínas de fusión de la misma polaridad, sus sitios de unión están en hebras opuestas del ADN en la región de interés.

En realizaciones adicionales, se usan dos proteínas de fusión de polaridad opuesta. En este caso, los sitios de unión para las dos proteínas están sobre la misma hebra de ADN.

El sitio de escisión está generalmente localizado entre los sitios de unión de las dos proteínas de fusión. Puede estar separado del borde próximo del uno o el otro de los sitios de unión por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 o más nucleótidos.

Una proteína de fusión puede expresarse en una célula, por ejemplo, administrando la proteína de fusión a la célula o administrando un polinucleótido que codifica la proteína de fusión a una célula, en la que el polinucleótido, si es ADN, se transcribe, y una molécula de ARN administrada a la célula o un transcrito de una molécula de ADN administrado a la célula se traduce, para generar la proteína de fusión. Métodos para la administración de polinucleótidos y polipéptidos a células se conocen en la técnica y se presentan en cualquier parte en la presente divulgación.

En ciertas realizaciones, el dominio de escisión puede comprender dos medios dominios de escisión que están covalentemente ligados en el mismo polipéptido. Los dos medios dominios de escisión pueden derivarse de la misma endonucleasa o de endonucleasas diferentes.

En realizaciones adicionales, la escisión dirigida de cromatina... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para escindir cromatina celular en una región de interés, comprendiendo el método:

(a) seleccionar la región de interés;

(b) manipular un primer dominio de unión de dedos de cinc para unirse a una primera secuencia de nucleótidos en la región de interés;

(c) proporcionar un segundo dominio de unión de dedos de cinc que se une a una segunda secuencia de nucleótidos en la región de interés, en el que la segunda secuencia se localiza entre 2 y 50 nucleótidos de la primera secuencia;

(d) expresar una primera proteína de fusión en la célula, comprendiendo la primera proteína de fusión el primer dominio de unión de dedos de cinc y un primer medio dominio de escisión; y

(e) expresar una segunda proteína de fusión en la célula, comprendiendo la segunda proteína de fusión el segundo dominio de unión de dedos de cinc y un segundo medio dominio de escisión; en el que

(i) la primera proteína de fusión se une a la primera secuencia de nucleótidos,

(ii) la segunda proteína de fusión se une a la segunda secuencia de nucleótidos,

(iii) dicha unión de la primera y segunda proteínas de fusión posiciona los medios dominios de escisión de forma que la cromatina celular se escinda en la región de interés, y iv) en al menos una de la primera o segunda proteínas de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la escisión se produce entre la primera y segunda secuencias de nucleótidos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo dominio de unión de dedos de cinc se manipula para unirse a la segunda secuencia de nucleótidos.

4. El método de la reivindicación 1, en el que el primer y segundo medios dominios de escisión son de la misma endonucleasa.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la endonucleasa es una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la endonucleasa de restricción de tipo IIS es Fok I.

7. El método de la reivindicación 1, en el que la cromatina celular está en un cromosoma.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el primer medio dominio de escisión es de una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

9. El método de la reivindicación 1, en el que el segundo medio dominio de escisión es de una endonucleasa de restricción de tipo IIS.

10. El método de la reivindicación 1, en el que la primera y segunda secuencias de nucleótidos están sobre hebras opuestas de ADN.

11. El método de la reivindicación 10, en el que, en la primera y segunda proteínas de fusión, los medios dominios de escisión están más próximos a los extremos N y los dominios de unión de dedos de cinc están más próximos a los extremos C.

12. El método de la reivindicación 1, en el que la primera y segunda secuencias de nucleótidos están sobre la misma hebra de ADN.

13. El método de la reivindicación 12, en el que, en la primera proteína de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C y, en la segunda proteína de fusión, el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo N y el medio dominio de escisión está más próximo al extremo C.

14. El método de la reivindicación 12, en el que, en la primera proteína de fusión, el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo N y el medio dominio de escisión está más próximo al extremo C y, en la segunda proteína de fusión, el medio dominio de escisión está más próximo al extremo N y el dominio de unión de dedos de cinc está más próximo al extremo C.

 

Patentes similares o relacionadas:

Composición de vacuna, del 29 de Mayo de 2019, de Turnstone Limited Partnership: Partícula viral Maraba MG1 aislada que tiene un genoma que codifica para una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: […]

Composición farmacéutica que contiene, como ingrediente activo, la proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos o la proteína de fusión de transferrina de la misma, del 8 de Mayo de 2019, de SUPEX BNP CO., LTD: Una proteína de fusión en la que la transferrina está unida por un péptido a un terminal de una proteína mutante del factor estimulante de colonias de granulocitos […]

Selección de células que expresan polipéptidos heterómeros, del 30 de Abril de 2019, de IMMUNEX CORPORATION: Un método para producir y aislar un complejo de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina heterómera que comprende transfectar células con un vector […]

Proteínas de fusión y métodos para tratar, prevenir o mejorar el dolor, del 24 de Abril de 2019, de Ipsen Bioinnovation Limited: Una proteína de fusión polipeptídica de cadena sencilla, que comprende: a. una proteasa no citotóxica, proteasa que escinde una proteína del […]

Proteínas de fusión y usos de las mismas, del 17 de Abril de 2019, de MORPHOSYS AG: Una proteína de fusión que comprende una proteína de membrana fusionada en el terminal N a una proteína principal de la cápsida de un retrovirus, […]

Expresión de una proteína quimérica KSAC y procedimiento de producción de proteínas solubles a alta presión, del 17 de Abril de 2019, de Boehringer Ingelheim Animal Health USA Inc: Procedimiento para producir una proteína soluble expresada en procariotas o eucariotas que comprende las etapas de: (i) preparar cuerpos de inclusión […]

Proteínas que tienen actividad nucleasa, proteínas de fusión y usos de estas, del 15 de Abril de 2019, de HELMHOLTZ ZENTRUM MUNCHEN DEUTSCHES FORSCHUNGSZENTRUM FUR GESUNDHEIT UND UMWELT (GMBH): Una molécula de ácido nucleico que codifica (I) un polipéptido que tiene la actividad de una endonucleasa, que es (a) una molécula de ácido nucleico que codifica […]

Enzimas y métodos para la síntesis del estireno, del 15 de Abril de 2019, de Phytogene, Inc: Una célula hospedadora que comprende: (a) una proteína de fusión expresada recombinantemente que comprende un primer dominio que comprende una fenilalanina amonio liasa, […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .