Proteínas de unión con dedos de zinc modificadas.

Una proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada que ha sido modificada genéticamente para unirse a una secuencia de ADN diana,

donde

(i) la proteína de unión a ADN con dedos de zinc comprende 3 dedos de zinc,

(ii) los dedos de zinc primero y segundo son de la clase C2H2 y el tercer dedo de zinc es un dedo de zinc no canónico que comprende la secuencia X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X1-7-Cys-X4 donde X es cualquier aminoácido y donde X12 comprende una región de la hélice de reconocimiento que se une al sitio de diana; y

(iii) la región de la hélice de reconocimiento del dedo de zinc no canónico está modificada genéticamente para unirse al sitio diana.

Proteínas de unión con dedos de zinc modificadas

Campo técnico Los métodos y composiciones descritos en la presente memoria se refieren en general al campo de la regulación de la expresión génica y específicamente a métodos para modular la expresión génica mediante la utilización de polipéptidos derivados de proteínas de unión a nucleótidos con dedos de zinc.

Antecedentes La unión de proteínas a secuencias específicas de ADN, ARN, proteínas y otras moléculas participa en cantidad de procesos celulares tales como, por ejemplo, la transcripción, la replicación, la estructura de la cromatina, la recombinación, la reparación del ADN, el procesado del ARN y la traducción. La especificidad de unión de las proteínas de unión celulares que participan en las interacciones proteína-ADN, proteína-ARN y proteína-proteína contribuye al desarrollo, la diferenciación y la homeostasis. Las alteraciones en las interacciones de proteínas específicas pueden estar implicadas en varios tipos de patologías tales como, por ejemplo, el cáncer, la enfermedad cardiovascular y la infección.

Las proteínas con dedos de zinc (ZFP) son proteínas que pueden unirse a una secuencia de ADN de forma específica. Los dedos de zinc se identificaron por primera vez en el factor de transcripción TFIIIA de los ovocitos de la rana africana de uñas, Xenopus laevis. Un único dominio de un dedo de zinc de esta clase de ZFP tiene una longitud de aproximadamente 30 aminoácidos, y varios estudios estructurales han demostrado que contiene un giro beta (que contiene los dos restos invariables de cisteína) y una hélice alfa (que contiene los dos restos invariables de histidina) , que adopta una conformación particular mediante la coordinación de un átomo de zinc con dos cisteínas y dos histidinas. Esta clase de ZFP se conoce también como ZFP C2H2. También se han propuesto otras clases de ZFP. (Véase, por ejemplo, Jiang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:10723-10730 for a discussion of Cys-Cys-His-Cys (C3H) ZPFs.) Hasta la fecha, se han identificado más de 10.000 secuencias de dedos de zinc en varios miles de factores de transcripción conocidos o hipotéticos. Los dominios de los dedos de zinc están implicados no sólo en el reconocimiento del ADN, sino también en la unión al ARN y en la unión proteína-proteína. Las estimaciones actuales son que esta clase de moléculas constituirá aproximadamente el 2% de todos los genes humanos.

La mayoría de las proteínas con dedos de zinc han conservado restos de cisteína e histidina que coordinan tetraédricamente con el único átomo de zinc de cada dominio del dedo. En particular, la mayoría de las ZFP se caracterizan por componentes de los dedos de la secuencia general:-Cys- (X) 2, 4-Cys- (X) 12-Su- (X) 3, 5-His (SEQ ID NO: 1) , donde X es cualquier aminoácido (ZFP C2H2) . Las secuencias de coordinación de zinc de la clase más ampliamente representada contienen dos cisteínas y dos histidinas con espaciados particulares, por ejemplo, los dedos de zinc que se encuentran en la proteína ADRI de levadura, la proteína ZFY asociada a humanos varones, la proteína potenciadora del VIH y la proteína Xfin de Xenopus han sido resueltas por métodos de RMN de alta resolución (Kochoyan, et al, Biochemistr y , 30:3371-3386, 1991;Omichinski, et al, Biochemistr y , 29:9324-9334, 1990; Lee, et al, Science, 245:635-637, 1989) .Basándose en la cristalografía de rayos X, se ha resuelto la estructura tridimensional de un complejo ADN-polipéptido de tres dedos derivado de la proteína temprana inmediata de ratón zif268 (también conocida como Krox-24) . (Pavletich and Pabo, Science, 252:809-817, 1991) . La estructura plegada de cada dedo contiene un giro β antiparalelo, una región punta de dedo y una α-hélice anfipática corta. Los ligandos de coordinación del metal se unen al ion Zn y, en el caso de los dedos de zinc zif268, la α-hélice anfipática corta se une al surco mayor del ADN. Además, los aminoácidos hidrófobos conservados y la coordinación del zinc por los restos cisteína e histidina estabilizan la estructura del dominio del dedo individual.

El plegado de una ZFP C2H2 en la estructura de dedo adecuada puede ser completamente interrumpido por el cambio de los aminoácidos ligando de C2H2. Miura et al. (1998) Biochim. Biophys. Acta 1384:171-179. Además, se puede alterar la especificidad de unión al metal de los péptidos basada en la secuencia consenso de C2H2. Krizek et al. (1993) Inorg. Chem.32:937-940; Merkle et al. (1991) J. Am. Chem. Soc.113:5450-5451. Aunque también se han propuesto modelos detallados para la interacción de los dedos de zinc y el ADN (Berg, 1988; Berg, 1990; Churchill, et al, 1990) , las mutaciones en el dedo 2 de la ZFP C2H2 zif268 de tres dedos han demostrado que eliminan totalmente la unión al ADN (Green et al. (1998) Biochem. J. 333:85-90) .

No obstante, una mayor comprensión de la naturaleza y el mecanismo de la especificidad de unión a proteínas ha alentado la esperanza de que la especificidad de unión de una proteína podría ser alterada de una manera predecible, o que se podría construir de novo una proteína de unión de especificidad predeterminada. Véase, por ejemplo, Blackburn (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:399-400; Segal et al. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol.4:34-39.

Para este fin, se han hecho intentos de modificar proteínas con dedos de zinc C2H2.Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. nº 6.007.988; 6.013.453; 6.140.081; PCT WO 98/53057; PCT WO 98/53058; PCT WO 98/53059; PCT WO 98/53060; PCT WO 00/23464; PCT WO 00/42219; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Segal et al. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:34-39, y las referencias citadas en estas publicaciones.

Hasta la fecha, sin embargo, en los estudios celulares utilizando ZFP C2H2 de diseño se han utilizado relativamente pocas posiciones en el dedo de zinc como parámetros ajustables para obtener una actividad óptima. En particular, hasta la fecha los estudios han modificado sólo aquellos restos en la interfaz dedo-ADN. Estos incluyen posiciones conocidas por hacer contactos directos con la base, restos de 'apoyo' o 'yuxtaposición' inmediatamente adyacentes a las posiciones de contacto de la base, y posiciones capaces de contactar con el esqueleto de fosfato del ADN. Además, muchos de los efectos observados han sido bastante modestos, y la posibilidad de que la mejora de las actividades de ZFP se podría lograr a través de la sustitución de restos en otras posiciones del dedo o utilizando polipéptidos no-C2H2 queda completamente sin investigar.

Por tanto, existe una necesidad de diseños adicionales o de proteínas de unión con dedos de zinc seleccionadas.

Compendio En la presente memoria se describen proteínas de unión, en particular proteínas de unión con dedos de zinc, con sitios de coordinación metálicos modificados. Se proporcionan también métodos de fabricación y uso de estas proteínas. Según la presente invención, las proteínas de unión contienen tres dedos de zinc coordinados y el tercero de estos dedos es un componente del dedo modificado, no canónico (por ejemplo, no-C2H2) . Preferiblemente, el tercer dedo de una ZFP con tres dedos está modificado y no canónico.

La proteína de unión con dedo de zinc aislada, no canónica de la presente invención se une a una secuencia diana. La proteína de unión con dedo de zinc aislada se puede proporcionar como una molécula de ácido nucléico o como un polipéptido. Además, la secuencia diana puede ser un aminoácido, ADN (por ejemplo, una secuencia promotora)

o ARN y, adicionalmente, puede estar en una célula procariota (por ejemplo, bacterias) o eucariota (por ejemplo, célula vegetal, célula de levadura, célula fúngica, célula animal humana) .

La secuencia de aminoácidos del componente del tercer dedo de zinc es X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X1-7-Z-X4 en la que X es cualquier aminoácido, y Z es Cys.

Las proteínas con dedos de zinc modificadas descritas en la presente memoria pueden incluir cualquier número componentes del coordinados en el que uno o más de los dedos de zinc coordinados son no canónicos. Según la presente invención, la ZFP comprende tres dedos, en donde el componente del tercer dedo es no canónico. En otras realizaciones, cualquiera de las ZFP descrita en este documento comprende un esqueleto de ZFP vegetal modificado.

En otros aspectos, se proporcionan los polipéptidos de fusión que comprenden (a) cualquiera de las proteínas de unión con dedos de zinc descritas en la presente memoria y (b) al menos un dominio funcional. El dominio funcional puede ser, por ejemplo, un dominio represor tales como KRAB, MBD-2B, v-ErbA, MBD3, TR, y miembros de la familia DNMT; un dominio de activación,... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada que ha sido modificada genéticamente para unirse a una secuencia de ADN diana, donde

(i) la proteína de unión a ADN con dedos de zinc comprende 3 dedos de zinc,

(ii) los dedos de zinc primero y segundo son de la clase C2H2 y el tercer dedo de zinc es un dedo de zinc no canónico que comprende la secuencia X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X1-7-Cys-X4 donde X es cualquier aminoácido y donde X12 comprende una región de la hélice de reconocimiento que se une al sitio de diana; y

(iii) la región de la hélice de reconocimiento del dedo de zinc no canónico está modificada genéticamente para unirse al sitio diana.

2. La proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada de la reivindicación 1, dónde la secuencia diana está en una célula vegetal.

3. La proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada de la reivindicación 1, dónde la secuencia diana está en una célula animal.

4. La proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada de la reivindicación 1, dónde la secuencia diana está en una célula humana.

5. La proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada de la reivindicación 1, dónde la secuencia diana es una secuencia promotora.

6. La proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada de la reivindicación 1, que consiste en tres dedos de zinc.

7. La proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada de la reivindicación 1, dónde la secuencia diana comprende aproximadamente de 9 a aproximadamente 14 pares de bases contiguos.

8. Un polipéptido aislado que codifica proteína de unión a ADN con dedos de zinc según la reivindicación 1.

9. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

10. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 8.

11. Un polipéptido de fusión que comprende:

(a) Una proteína de unión a ADN con dedos de zinc aislada que ha sido modificada para unirse a una secuencia diana de ADN, donde

(i) la proteína de unión a ADN con dedos de zinc comprende 3 dedos de zinc,

(ii) los dedos de zinc primero y segundo son de la clase C2H2 y el tercer dedo de zinc es un dedo de zinc no canónico que comprende la secuencia X3-Cys-X2-4-Cys-X12-His-X1-7-Cys-X4, donde X es cualquier aminoácido y donde X12 comprende una región de la hélice de reconocimiento que se une al sitio de diana; y

(iii) la región de la hélice de reconocimiento del dedo de zinc no canónico está modificada para unirse al sitio diana; y

(b) por lo menos un dominio funcional

12. El polipéptido de fusión de la reivindicación 11, donde el dominio funcional es un dominio represivo.

13. El polipéptido de fusión de la reivindicación 12, donde el dominio funcional es ROM2 o AtD2A.

14. El polipéptido de fusión de la reivindicación 11, donde el dominio funcional es un dominio de activación.

15. El polipéptido de fusión de la reivindicación 14, donde el dominio de activación se selecciona del grupo que consiste en PvALF, ERF-2, OsGA1, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, ARF-6, ARF-7, ARF-8, CPRF-1, CPRF4, MYC-RP/GP y TRAB1.

16. El polipéptido de fusión de la reivindicación 11, donde el dominio funcional se selecciona del grupo que consiste en un dominio aislante, una proteína remodeladora de la cromatina o un dominio de unión a metilo.

17. Una célula que comprende el polipéptido de fusión de la reivindicación 11.

18. Un polinucleótido aislado que codifica el polipéptido de fusión de la reivindicación 11.

19. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18.

20. Una célula hospedadora que comprende el polinucleótido de la reivindicación 18.

21. Un método para modular la expresión de un gen dónde dicho método comprende la etapa de contactar una región de ADN con una molécula de fusión según la reivindicación 11.

22. El método de la reivindicación 21, donde el gene está en una célula vegetal.

23. El método de la reivindicación 22, donde la proteína de unión a ADN con dedos de zinc de la molécula de fusión se une a un sitio diana en un gen que codifica un producto seleccionado del grupo que consiste en FAD2-1, desaturasa delta-9, desaturasa delta-12, desaturasa delta-15, acetil-CoA carboxilasa, acil-ACP tioesterasa, ADP glucosa pirofosforilasa, almidón sintasa, celulosa sintasa, sacarosa sintasa, liasa de hidroperóxidos de ácidos grasos, poligalacturonasa, y EPSP sintasa.

24. El método de la reivindicación 21, donde el gen está en una célula animal.

25. El método de la reivindicación 24, donde el gen está en una célula humana.

26. Una composición farmacéutica que comprende una proteína con dedos de zinc no canónica según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 11 y un excipiente aceptable farmacéuticamente.

27. Una composición que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 18 y un excipiente aceptable farmacéuticamente.

28. Un método para producir una proteína de unión a ADN con dedos de zinc de la reivindicación 1 o un polipéptido de fusión de la reivindicación 11, que comprende las etapas a) introducir una ácido nucléico que codifica una proteína de unión a ADN con dedos de zinc de la reivindicación 1 20 o el polipéptido de fusión de la reivindicación 11 dentro de la célula hospedadora, y

b) expresar la proteína de unión a ADN con dedos de zinc de la reivindicación 1 o el polipéptido de fusión de la reivindicación 11 en la célula hospedadora.

29. El método de la reivindicación 28 comprende además purificar la proteína de unión a ADN con dedos de zinc de la reivindicación 1 o el polipéptido de fusión de la reivindicación 11.