Métodos y composiciones para la producción de pares ortogonales de ARNt-aminoacil-ARNt sintetasa.

Un par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt, que dirige la incorporación de un aminoácido no natural en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido,

donde la aminoacil ARNt sintetasa presenta selectividad por el aminoácido no natural en comparación con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes, dicho ARNt es específico para un codón de parada ámbar en el ARNm que codifica el polipéptido y la aminoacil ARNt sintetasa aminoacila el ARNt con el aminoácido no natural,

donde dicho aminoácido no natural se selecciona entre el grupo que consiste en: para acetil fenilalanina, para amino fenilalanina y para nitro fenilalanina,

y donde la aminoacil ARNt sintetasa se puede obtener mediante un método que comprende:

crear una biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii;

seleccionar positivamente de la biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii miembros que aminoacilen dicho ARNt en presencia de dicho aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando de este modo una reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii;

seleccionar negativamente de la reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii aminoacil ARNt sintetasas mutantes de Methanococcus jannaschii que aminoacilen dicho ARNt en ausencia del aminoácido no natural; y

obtener de este modo la aminoacil ARNt sintetasa que aminoacila preferentemente dicho ARNt con dicho aminoácido no natural.

Métodos y composiciones para la producción de pares ortogonales de ARNt-aminoacil-ARNt sintetasa Campo de la invención La invención se refiere al campo de bioquímica de traducción. En particular, la invención se refiere a métodos para producir ARNt ortogonales mutados, aminoacil-ARNt sintetasas ortogonales mutadas, y pares de los mismos. También se proporcionan métodos para identificar pares ortogonales, que se usan para la incorporación de aminoácidos no naturales en proteínas in vivo, y composiciones relacionadas.

Antecedentes de la invención Las proteínas portan casi todos los procesos complejos de la vida, desde la fotosíntesis hasta la transducción de señales y la respuesta inmune. Para comprender y controlar estas actividades intrincadas, se necesita una mejor comprensión de la relación entre la estructura y la función de las proteínas.

A diferencia de la síntesis de moléculas orgánicas pequeñas donde casi cualquier cambio estructural puede hacerse para influir en las propiedades funcionales de un compuesto, la síntesis de proteínas está limitada a cambios codificados por los veinte aminoácidos naturales. El código genético de todo organismo conocido, desde bacterias a seres humanos, codifica los mismos veinte aminoácidos comunes. Estos aminoácidos pueden modificarse por modificación post-traduccional de proteínas, por ejemplo, glucosilación, fosforilación u oxidación, y en casos más raros, mediante modificación enzimática de los ARNt supresores aminoacilados, por ejemplo, en el caso de selenocisteína. No obstante, los polipéptidos, que se sintetizan a partir de solamente estos 20 bloques de construcción simple, portan todos los procesos complejos de la vida.

Tanto la mutagénesis dirigida al sitio como la mutagénesis aleatoria, en que aminoácidos específicos en una proteína pueden remplazarse con cualquiera de los otros diecinueve aminoácidos comunes, se han convertido en herramientas importantes para comprender la relación entre la estructura y la función de las proteínas. Estas metodologías han hecho posible la generación de proteínas con propiedades potenciadas, incluyendo estabilidad, actividad catalítica y especificidad de unión. No obstante, los cambios en las proteínas se limitan a los 20 aminoácidos comunes, la mayoría de los cuales tienen grupos funcionales simples. Véase, Knowles, J. R. Tinkering with enzymes: what are we learning? Science, 236:1252-1258 (1987) ; y, Zoller, M. J., Smith, M. Oligonucleotidedirected mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors, Methods Enzymol, 100:468-500 (1983) . Expandiendo el código genético para incluir aminoácidos adicionales con nuevas propiedades biológicas, químicas o físicas, pueden modificarse las propiedades de las proteínas, por ejemplo, el tamaño, la acidez, la nucleofilicidad, los enlaces de hidrogeno, las propiedades hidrófobas, etc., en comparación con una proteína compuesta solamente de aminoácidos de los 20 aminoácidos comunes, por ejemplo, como en una proteína de origen natural.

Se han empleado varias estrategias para introducir aminoácidos no naturales en proteínas. Los primeros experimentos implicaron la derivatización de aminoácidos con cadenas laterales reactivas tales como Lys, Cys y Tyr, por ejemplo, la conversión de lisina en N!-acetil-lisina. La síntesis química también proporciona un método directo para incorporar aminoácidos no naturales, pero la síntesis de péptidos rutinaria en fase sólida generalmente está limitada a péptidos pequeños o proteínas con menos de 100 restos. Con el reciente desarrollo del ligamiento enzimático y el ligamiento químico nativo de fragmentos peptídicos, es posible fabricar proteínas más grandes, pero dichos métodos no son fácilmente escalables. Véase, por ejemplo, P. E. Dawson y S. B. H. Kent, Annu. Rev. Biochem., 69:923 (2000) . Un método biosintético in vitro general en que se añade un ARNt supresor acilado químicamente con el aminoácido no natural deseado a un extracto in vitro capaz de soportar la biosíntesis de proteínas, se ha usado para incorporar de forma específica de sitio más de 100 aminoácidos no naturales en una diversidad de proteínas de casi cualquier tamaño. Véase, por ejemplo, V. W. Cornish, D. Mendel y P. G. Schultz, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34:621 (1995) ; C. J. Noren, S.J. Anthony-Cahill, M.C. Griffith, P. G. Schultz, A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins, Science 244 182-188 (1989) ; y,

J. D. Bain, C. G. Glabe, T. A. Dix, A. R. Chamberlin, E. S. Diala, Biosynthetic site-specific incorporation of a nonnatural amino acid into a polypeptide, J. Am. Chem. Soc. 111 8013-8014 (1989) . Se ha introducido una amplia gama de grupos funcionales en proteínas para estudios de estabilidad proteica, plegamiento proteico, mecanismo enzimático, y transducción de señales. Aunque estos estudios demuestran que la maquinaria sintética de proteínas tolera una amplia diversidad de cadenas laterales de aminoácido, el método es técnicamente complejo, y los rendimientos de proteínas mutantes son bajos.

Hace más de 50 años, se descubrió que muchos análogos de aminoácidos naturales inhiben el crecimiento bacteriano. El análisis de las proteínas producidas en presencia de estos análogos de aminoácidos reveló que se habían sustituido en el lugar de sus equivalentes naturales en diversos grados. Véase. Por ejemplo, M. H. Richmond, Bacteriol. Rev., 26:398 (1962) . Esto sucede porque la aminoacil-ARNt sintetasa, la enzima responsable de la unión del aminoácido correcto a su ARNt afín, no puede distinguir de forma rigurosa el análogo del aminoácido natural correspondiente. Por ejemplo, la norleucina se carga por la metionil-ARNt sintetasa, y la p-fluorofenilalanina se carga por la fenilalanina-ARNt sintetasa. Véase, por ejemplo, D. B. Cowie, G. N. Cohen, E. T. Bolton y H. de Robichon-Szulmajster, Biochim. Biophys. Acta, 1959, 34:39 (1959) ; y, R. Munier y G. N. Cohen, Biochim. Biophys. Acta, 1959, 31:378 (1959) .

Un método in vivo, llamado incorporación por presión selectiva, se desarrolló posteriormente para explotar la promiscuidad de las sintetasas de tipo silvestre. Véase, por ejemplo, N. Budisa, C. Minks, S. Alefelder, W. Wenger,

F. M. Dong, L. Moroder y R. Huber, FASEB J., 13:41 (1999) . Una cepa auxotrófica, en que la vía metabólica relevante que suministra a la célula un aminoácido natural particular está desactivada, se cultiva en medio mínimo que contiene concentraciones limitadas del aminoácido natural, mientras se bloquea la transcripción del gen diana. Al inicio de una fase de crecimiento estacionaria, el aminoácido natural se consume y remplaza con el análogo no natural del aminoácido. La inducción de la expresión de la proteína recombinante provoca la acumulación de una proteína que contiene el análogo no natural. Por ejemplo, usando esta estrategia, se han incorporado o, m y pfluorofenilalaninas en proteínas, y muestran dos hombros característicos en el espectro UV que pueden identificarse fácilmente, véase, por ejemplo, C. Minks, R. Huber, L. Moroder y N. Budisa, Anal. Biochem., 284:29 (2000) ; se ha usado trifluorometionina para remplazar metionina en la lisozima del bacteriófago ∀ para estudiar su interacción con ligandos de quitooligosacárido por 19F NMR, véase, por ejemplo, H. Duewel, E. Daub, V. Robinson y J. F. Honek, Biochemistr y , 36: 3404 (1997) ; y se ha insertado trifluoroleucina en lugar de leucina, provocando una estabilidad térmica y química aumentada de una proteína de cremallera de leucina. Véase, por ejemplo, Y. Tang, G. Ghirlanda,

W. A. Petka, T. Nakajima, W. F. DeGrado y D. A. Tirrell, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 40:1494 (2001) . Además, se incorporan selenometionina y telurometionina en diversas proteínas recombinantes para facilitar la solución de fases en cristalografía de rayos-X. Véase, por ejemplo, W. A. Hendrickson, J. R. Horton y D. M. Lemaster, EMBO J., 9:1665 (1990) ; J. O. Boles, K. Lewinski, M. Kunkle, J. D. Odom, B. Dunlap, L. Lebioda y M. Hatada, Nat. Struct. Biol.,

1:283 (1994) ; N. Budisa, B. Steipe, P. Demange, C. Eckerskorn, J. Kellermann y R. Huber, Eur. J. Biochem., 230:788 (1995) ; y, N. Budisa, W. Karnbrock, S. Steinbacher, A. Humm, L. Prade, T. Neuefeind, L. Moroder y R. Huber, J. Mol. Biol., 270:616 (1997) . También se han insertado de forma eficaz análogos de metionina con funcionalidades alqueno o alquino, permitiendo la modificación adicional de las proteínas por medios químicos. Véase, por ejemplo, J. C. M. van Hest y D. A. Tirrell, FEBS Lett., 428:68 (1998) ; J. C. M. van Hest, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, J. Am. Chem. Soc., 122:1282 (2000) ; y, K. L. Kiick y D. A. Tirrell, Tetrahedron, 56:9487 (2000) .

El éxito... [Seguir leyendo]

1. Un par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt, que dirige la incorporación de un aminoácido no natural en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, donde la aminoacil ARNt sintetasa presenta selectividad por el aminoácido no natural en comparación con cualquiera de los veinte aminoácidos comunes, dicho ARNt es específico para un codón de parada ámbar en el ARNm que codifica el polipéptido y la aminoacil ARNt sintetasa aminoacila el ARNt con el aminoácido no natural, donde dicho aminoácido no natural se selecciona entre el grupo que consiste en: para acetil fenilalanina, para amino fenilalanina y para nitro fenilalanina, y donde la aminoacil ARNt sintetasa se puede obtener mediante un método que comprende: crear una biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii; seleccionar positivamente de la biblioteca de aminoacil ARNt sintetasas mutadas de Methanococcus jannaschii miembros que aminoacilen dicho ARNt en presencia de dicho aminoácido no natural y un aminoácido natural, proporcionando de este modo una reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii; seleccionar negativamente de la reserva de aminoacil ARNt sintetasas mutadas activas de Methanococcus jannaschii aminoacil ARNt sintetasas mutantes de Methanococcus jannaschii que aminoacilen dicho ARNt en ausencia del aminoácido no natural; y obtener de este modo la aminoacil ARNt sintetasa que aminoacila preferentemente dicho ARNt con dicho aminoácido no natural.

2. El par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt de la reivindicación 1, donde el aminoácido no natural no es un sustrato para otras sintetasas.

3. Una célula que comprende el par de aminoacil ARNt sintetasa y ARNt de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2.

4. La célula de la reivindicación 3, donde el aminoácido no natural no es un sustrato para sintetasas endógenas de la célula.

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