Métodos para la amplificación de ácido nucleico.

Un método de detección homogéneo para detectar variantes alélicas de al menos una secuencia objetivo de ácido nucleico mediante el uso de un método de amplificación por PCR no simétrica,

que comprende:

(a) formar una mezcla de reacción de amplificación que incluye dicha al menos una secuencia objetivo de ácido nucleico, iniciadores para la amplificación por PCR no simétrica, y al menos una sonda de hibridación marcada con fluoróforo, tolerante a desajustes;

(b) amplificar dicha secuencia objetivo de ácido nucleico mediante dicho método de amplificación por PCR no simétrica generando moléculas de amplicón monocatenarias;

(c) detectar la emisión de fluorescencia a partir de dicha al menos una Sonda. a una primera temperatura de detección y una temperatura de detección inferior, en donde dicha sonda señaliza tras la hibridación debido a la excitación del marcador de fluoróforo de la sonda y se une a secuencias progresivamente más coincidentes a medida que la disminuye la temperatura, en donde dicha sonda es discriminante de alelo a dicha temperatura la primera detección y tolerante a desajustes a la temperatura de detección inferior debido a la Tm de la sonda para la secuencia objetivo; y

(d) determinar la constitución alélica de dicha al menos una secuencia objetivo normalizando dicha emisión de fluorescencia de la sonda como una relación de las emisiones a dicha primera temperatura de detección y dicha temperatura de detección inferior y comparar la relación con las relaciones esperadas establecidas para los genotipos conocidos.

Métodos para la amplificación de ácido nucleico Campo técnico

Esta invención se relaciona con reacciones de amplificación de ácido nucleico, que incluyen amplificaciones que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa, y ensayos que utilizan tales reacciones en combinación con métodos de detección de sondas de hibridación y de secuenciación.

Antecedentes

Las técnicas y ensayos de amplificación de ácidos nucleicos son bien conocidos. Algunas reacciones de amplificación son isotérmicas, tales como la amplificación basada en secuencia de ácido nucleico (NASBA). Otras emplean ciclos térmicos, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los ensayos de amplificación preferidos que emplean detección por fluorescencia del producto amplificado son homogéneos, es decir, que no requieren la separación física de los reactivos para permitir la detección (por ejemplo, separación de sondas unidas de las sondas no unidas) y se pueden realizar en un único recipiente cerrado. Tales ensayos pueden ser de punto final, en donde el producto se detecta después de la amplificación, o pueden ser en tiempo real, en donde el producto se detecta según procede la amplificación.

La amplificación de ácido nucleico y los ensayos que emplean PCR se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 4,683,202, 4,683,195 y4,965,188, y, generalmente, PCR PROTOCOLS, a guide to Methods and Applications, Innis y otros eds., Academic Press (San Diego, CA (USA) 1990). Los ensayos de PCR homogéneos, que incluyen ensayos en tiempo real, en los que el producto amplificado se detecta durante todos o algunos de los ciclos de PCR cuando la reacción procede se describen, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 5,994,056,5,487,972, 5,925,517 y 6,150,097.

Las reacciones de amplificación por PCR generalmente se diseñan que sean simétricas, es decir, para fabricar amplicones de cadena doble de forma exponencial por la utilización de iniciador directo e iniciador reverso en concentraciones equimolares y temperaturas iguales de fusión (Tm's). Una técnica que ha encontrado un uso limitado para la fabricación de ADN monocatenario directamente en una reacción de PCR es "PCR asimétrica." Gyllensten y Erlich, "Generation of Single- Stranded DNA by the Polymerase Chain Reaction and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus," Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 85: 7652-7656 (1988); y la patente de Estados Unidos 5,066,584. La PCR asimétrica es un método de amplificación por PCR no simétrica que difiere de la PCR simétrica en que uno de los iniciadores se diluye de cinco veces a cien veces para estar presente en la cantidad limitante de 1-20 por ciento de la concentración del otro iniciador. Como consecuencia, la amplificación consiste en una fase exponencial en la que ambos iniciadores se extienden, generando el producto o amplicón, de cadena doble, seguido por una amplificación lineal en la que solo queda un iniciador, generando amplicón monocatenario.

Más recientemente, se ha desarrollado un método de amplificación por PCR no simétrica conocido como PCR "Lineal Después del Exponencial" o, para abreviar, "LATE-PCR"." LATE-PCR es una amplificación por PCR no simétrica que consiste en una fase exponencial en la que ambos iniciadores se aparean y se extienden seguido por una fase lineal después del agotamiento del Iniciador Limitante, mientras sólo se aparea y se extiende el iniciador de Exceso. Ver Sánchez y otros (2004) Proc. Nati. Acad. Sci. (USA) 101: 1933-1938, solicitud internacional de patente publicada WO 03/054233 (3 de julio de 2003), y Pierce y otros (2005) Proc. Nati. Acad. Sci (USA) 102: 8609-8614.

Un método conveniente y económico para controlar la producción de amplicón de cadena doble en una amplificación por PCR es usar un tinte que fluoresce tras intercalarse en, o interaccionar de cualquier otra forma con el ADN de cadena doble, tal como SYBR green o SYBR gold. Ver, por ejemplo, la patente de Estados Unidos 5,994,056. Los análisis de la temperatura de fusión de los amplicones realizados ya sea en tiempo real durante una amplificación por PCR o realizados después de la amplificación se usa para la identificación del producto. Un problema con la utilización de tales análisis de la temperatura de fusión es que la fluorescencia del tinte es una función del tamaño del amplicón. Otro problema es que los tintes se redistribuyen a partir de los productos de amplificación, o amplicones, que tienen temperaturas de fusión bajas a amplicones que tienen temperaturas de fusión más altas durante el análisis, lo que distorsiona de ese modo los resultados. Se han propuesto dos enfoques para resolver estos problemas. Un enfoque, desactivación G, impone severas restricciones en el diseño del iniciador y causa gran fluorescencia de fondo (Crockett AO, Wittwer CT. "Fluorescein-Labeled Oligonucleotides for Real-Time PCR: Using the Inherent Quenching of Deoxyguanosine Nucleotides" Anal. Biochem. 290:89- 97 (2001)). El otro, la sustitución de los tintes SYBR con tinte verde LC, produce un porcentaje de señal muy pequeño para

las secuencias no presentes en abundancia y requiere de un software y hardware altamente especializado (Wittwer y otros High-Resolution Genotyping by Amplicon Melting Analysis Using LCGreen," Clin. Chem. 49:853-860(2003).

Se usan sondas marcadas fluorescentes en ensayos de amplificación de ácidos nucleicos homogéneos, que incluyen los ensayos de PCR, para medir la acumulación del amplicón deseado, ya sea en análisis en tiempo real o de punto final Varios tipos de sondas disponibles son significativamente alelo discriminante en comparación con sondas monocatenarias lineales. Las sondas en tiempo real incluyen sondas lineales de doble etiquetado que se escinden por la actividad exonucleasa 5'-a-3' de la ADN-polimerasa durante la etapa de extensión de un ciclo PCR (ver las patentes de Estados Unidos 5,210,015, 5,487,972 y 5,538,848); sondas de baliza molecular (ver las patentes de Estados Unidos 5,925,517, 6,103,476 y 6,365,729); sondas de unión al surco menor (ver Afonina y otros "Minor Groove Binder-Conjugated DNA Probes for Quantitative DNA Detection by Hybridization-Triggered Fluorescence," Biotechniques 32: 946-949 (2002)); pares de sondas lineales FRET cuando hibridan adyacentemente en una cadena objetivo; sondas lineales de doble cadena inactivadas para las que un objetivo compite para hibridar la cadena de sonda marcada (ver Li, Q. y otros (2002), Nucí. Acid. Res. 30: e5); y las denominadas sondas de "iluminación", que son oligómeros de ácido nucleico peptídico (PNA) unidos a un tinte de cianina asimétrica que fluoresce cuando la sonda se une a un objetivo para formar una región de doble cadena. Para la LATE-PCR se ha utilizado sondas discriminantes de alelos de baja temperatura, tales como sondas de baliza molecular de baja temperatura (Ver WO 03/045233). Las sondas oligonucleotídicas marcadas se pueden unir a iniciadores mediante enlazadores tal que durante la amplificación las sondas no se copian sino que están libres para hibridarse con una secuencia objetivo resultante de la extensión del iniciador. Los ejemplos son Scorpions®, iniciadores a los que se unen sondas de baliza molecular, y Anglers®, iniciadores a los que se unen sondas lineales marcadas con fluoróforo. Lee, M.A. y otros (2002), Analytica Clinica Acta 457: 61:70; Whitcombe, D. y otros (1999), Nature Biotechnology 17: 804-807. La porción de la sonda de tales estructuras compuestas, que portan el marcador fluorescente, se híbrida por separado de la porción del iniciador. Así, son sondas marcadas e iniciadores no marcados, como se usan esos términos en la presente descripción. Sin embargo, las sondas específicas al objetivo carecen de la capacidad para controlar la producción total de productos de cadena doble.

Ciertas sondas son tolerantes a desajustes. Las sondas tolerantes a desajustes se hibridan con y generan la señal detectable para más de una secuencia objetivo a una temperatura de detección en un ensayo, y varios híbridos de esta manera formados tendrán diferentes puntos de fusión. Las sondas monocatenarias lineales, o espirales aleatorias, son generalmente tolerantes a desajustes. Los ejemplos de tales sondas son sondas lineales con una porción fluorescente interna cuyo nivel de fluorescencia aumenta tras la hibridación con una u otra cadena objetivo; sondas lineales marcadas de manera fluorescente usadas en combinación con tintes SYBR gold y SYBR green I, tal que la fluorescencia del marcador se produce por FRET a partir del tinte cuando la sonda se híbrida con uno u otro objetivo (ver la publicación de patente de Estados Unidos US 2002/0119450, 28 de agosto de 2002), denominado "balizas descuidadas", y variaciones de pares de sondas lineales... [Seguir leyendo]

1. Un método de detección homogéneo para detectar variantes alélicas de al menos una secuencia objetivo de ácido nucleico mediante el uso de un método de amplificación por PCR no simétrica, que comprende:

(a) formar una mezcla de reacción de amplificación que incluye dicha al menos una secuencia objetivo de ácido nucleico, iniciadores para la amplificación por PCR no simétrica, y al menos una sonda de hibridación marcada con fluoróforo, tolerante a desajustes;

(b) amplificar dicha secuencia objetivo de ácido nucleico mediante dicho método de amplificación por PCR no simétrica generando moléculas de amplicón monocatenarias;

(c) detectar la emisión de fluorescencia a partir de dicha al menos una Sonda, a una primera temperatura de detección y una temperatura de detección inferior, en donde dicha sonda señaliza tras la hibridación debido a la excitación del marcador de fluoróforo de la sonda y se une a secuencias progresivamente más coincidentes a medida que la disminuye la temperatura, en donde dicha sonda es discriminante de alelo a dicha temperatura la primera detección y tolerante a desajustes a la temperatura de detección inferior debido a la Tm de la sonda para la secuencia objetivo; y

(d) determinar la constitución alélica de dicha al menos una secuencia objetivo normalizando dicha emisión de fluorescencia de la sonda como una relación de las emisiones a dicha primera temperatura de detección y dicha temperatura de detección inferior y comparar la relación con las relaciones esperadas establecidas para los genotipos conocidos.

2. El método de la reivindicación 1 en donde la etapa de amplificar dicha secuencia objetivo de ácido nucleico incluye al menos una temperatura de hibridación del iniciador por encima de la primera temperatura de detección.

3. El método de la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en donde el método de amplificación por PCR no simétrica es LATE-PCR.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde la mezcla de reacción comprende adicionalmente un tinte de ADN fluorescente y en donde dicha sonda señala tras la hibridación debido a la excitación indirecta del marcador de fluoróforo de la sonda por el tinte.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde dicha etapa para detectar la emisión de fluorescencia a partir de dicha sonda implica detectar la fluorescencia a dos temperaturas inferiores de la primera temperatura de detección, una temperatura baja y una temperatura intermedia, y dicha relación se determina por la fórmula (Fs-Ft)/(Fb-Ft), donde Ft es la fluorescencia en dicha primera temperatura de detección, Fb es la fluorescencia en dicha temperatura baja, y Fs es la fluorescencia en dicha temperatura intermedia.

6. El método de la reivindicación 5 en donde la etapa de detectar la emisión de fluorescencia a partir de dicha sonda se lleva a cabo en tiempo real durante dicha etapa de amplificación de la secuencia objetivo de ácido nucleico.

7. El método de la reivindicación 5 en donde dicha etapa de detección se realiza después de la terminación de la reacción de amplificación como una detección de punto final.

8. El método de la reivindicación 1, en donde dicha etapa de detección se realiza después de la terminación de la reacción de amplificación como un análisis de fusión.