Detección basada en aptámero.

Una baliza de aptámero que se une a una molécula diana de ácido no nucleico específica,

comprendiendo la baliza de aptámero

un oligonucleótido que comprende una porción de bucle, un primer segmento, y un segundo segmento complementario al primer segmento, en el que los primero y segundo segmentos conectados por la parte de bucle forman una porción de tallo en ausencia de cualquier ácido no nucleico específico diana; en el que una porción del oligonucleótido comprende una región de unión que tiene una conformación secundaria o terciaria que cambia a una conformación secundaria o terciaria diferente tras la unión a la molécula de ácido no nucleico diana específica; y

en el que un primer resto indicador está unido al primer segmento; y un segundo resto indicador está unido al segundo segmento, en el que los primero y segundo restos indicadores interaccionan para producir una señal detectable cuando se cambia la distancia entre ellos;

en el que la unión específica de la molécula diana específica a la región de unión rompe los enlaces de los pares de bases en la porción de tallo, produciendo un cambio de conformación de la baliza de aptámero que separa los primero y segundo segmentos, alterando de este modo la distancia entre los primero y segundo restos indicadores y produciendo una señal detectable.

Detección basada en aptámero Campo de la invención La invención se refiere a composiciones, sistemas y procedimientos para detectar especies moleculares usando ácidos nucleicos.

Antecedentes de la invención Se han usado varios tipos de sistemas para detectar la presencia de una sustancia química o molécula concreta en una muestra compleja. Por ejemplo, los anticuerpos se usan para detectar la presencia de una proteína en una muestra, se han usado circuitos de micromatrices de ADN para identificar genes y la expresión génica del estudio. La mayoría de los sistemas de detección molecular existentes están diseñados para detectar la presencia de un único tipo o una única categoría de molécula diana. En el caso de detección de anticuerpos, los sistemas existentes están típicamente limitados a detectar únicamente una subpoblación de un tipo de molécula.

Recientemente se ha demostrado que aptámeros de ARN y ADN pueden sustituirse por los anticuerpos monoclonales en varias aplicaciones (Jayasena, "Aptamers: an emerging class of molecules that rival antibodies in diagnostics." Clin. Chem., 45 (9) :1628 -50, 1999; Morris et al., "High affinity ligands from in vitro selection: complex targets." Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 95 (6) :2902 -7, 1998) . El proceso de selección relativamente rápido de los aptámeros específicos y la barata síntesis convierte a los aptámeros en alternativas útiles a los anticuerpos monoclonales. Estos ácidos nucleicos se pueden sintetizar fácilmente, manipular fácilmente y se pueden almacenar durante un largo tiempo. Estos beneficios hacen de los ácidos nucleicos herramientas botecnolíoicas más atractivas que sus homólogos de proteínas y anticuerpos. Adicionalmente, estas sondas de ácido nucleico también se pueden marcar con radioisótopos, biotina o marcadores fluorescentes, y se pueden usar para detectar dianas en condiciones de vacío. SELEX ha desarrollado un número creciente de aptámeros de ADN y ARN que reconocen sus ácidos no nucleicos diana y se han caracterizado (Gold et al., "Diversity of Oligonucleotide Functions, " Annu. Rev. Biochem.,

64:763 -97, 1995: Bacher & Ellington. "Nucleic Acid Selection as a Tool for Drug Discover y , " Drug Discover y Today, 3 (6) :265 -273.1998) .

El documento WO 99/31275 que representa el estado de la técnica conforme al Artículo 54 (3) EPC, divulga un biochip diagnóstico de ácido nucleico para la detección de una molécula diana en una mezcla de ensayo que comprende un soporte sólido al que un o más ligandos de ácido nucleico específicos están unidos de un modo definido espacialmente. En una realización, los ligandos se unen a una molécula pequeña que será desplazada por la molécula diana. Este desplazamiento se detecta mediante fluorescencia.

Osbome et al, "Aptamers as therapeutic and diagnostic reagents: Problems and prospects" Current Opinion in Chemical Biology, Vol. 1, Nº 1 June 1997, páginas 5 -9, describe aptámeros marcados con fluoresceína inmovilizados en una superficie de cristal para generar señales dependientes de ligando.

Fang et al, "Designing a Novel Molecular Beacon for Surface-Immobilized DNA Hybridization Studies", J. Am. Chem. Soc. Vol. 121, Nº 12, páginas 2921 -2922, 31 March 1999, divulgan una baliza molecular que comprende un primer resto indicador unido a la primera porción del tallo y un Segundo resto indicador unido a la segunda porción del tallo, en la que la unión de la molécula de ácido nucleico Diana a la región del bucle rompe los enlaces de los pares de bases en la porción tallo.

El documento EP 0 826 780 A1 se refiere a una baliza molecular con una estructura de G-cuarteto que se despliega tras la hibridación en presencia de su secuencia de ácido nucleico complementaria.

Potyrailo et al, "Adapting selected nucleic acid ligands (aptamers) to biosensors", Anal. Chem., vol. 70, 1998, páginas 3419 -3425, divulgan aptámeros inmovilizados y marcados con fluorescencia.

Sumario de la invención La invención se refiere a nuevas composiciones, sistemas y procedimientos para detectar de forma simultánea la presencia y la cantidad de uno o más compuestos diferentes en una muestra usando nuevas moléculas sensoras de ácido nucleico como se define en las reivindicaciones. Anteriormente se ha demostrado que los ácidos nucleicos son capaces de unirse específicamente con alta afinidad a moléculas diana no nucleotídicas, tales como proteínas, moléculas orgánicas pequeñas o moléculas inorgánicas. Estos ácidos nucleicos habitualmente se denominan aptámeros. Un aptámero puede ser un ARN o un ADN compuesto de nucleótidos de origen natural o modificados.

En las composiciones nuevas, los aptámeros convencionales se modifican mediante bioingeniería de forma que la unión de un aptámero modificado por bioingeniería a una molécula diana produzca un cambio en la conformación del aptámero modificado por bioingeniería. Adicionalmente, dos restos o grupos indicadores están incluidos en los aptámeros modificados por bioingeniería de forma que el cambio en la conformación del aptámero modificado por bioingeniería tenga como resultado un cambo detectable de una propiedad física de al menos uno de los grupos

indicadores) . Estos aptámeros modificados por bioingeniería se denominan en el presente documento balizas de aptámeros.

Las balizas de aptámeros que tienen regiones de unión configuradas para unirse a diferentes moléculas diana se puede usar en varios procedimientos y sistemas de detección. Por ejemplo, las nuevas balizas de aptámeros se pueden usar en ensayos basados en solución o se pueden unir a un soporte sólido, por ejemplo a puntos predeterminados diferentes en una matriz uni o bidimensional, para usar en ensayos en base sólida. Las balizas de aptámero o matrices de balizas de aptámeros se exponen después a la muestra, de forma que las moléculas diana en la muestra se unen a sus respectivas balizas de aptámeros. La presencia de moléculas Diana unidas se puede detector midiendo un cambo en una propiedad física del grupo indicador de la baliza de aptámero, por ejemplo observando un cambio en la eficiencia de la fluorescencia de la baliza de aptámero.

Para ayuda a analizar la muestra, los nuevos sistemas de detección pueden incluir un software de reconocimiento de patrones. El software compara el patrón de unión de la molécula diana correspondiente a la muestra desconocida con los patrones de unión correspondientes a compuestos conocidos. A partir de estas comparaciones, el software puede determinar la composición de la muestra o deducir la información sobre la fuente de la muestra.

Los sistemas se pueden usar para detectar la existencia de compuestos característicos o "huellas moleculares" asociados con determinadas sustancias químicas o afecciones. Por ejemplo, los sistemas se pueden usar para analizar fármacos humanos detectando la presencia de metabolitos de fármacos concretos. Los sistemas también se pueden usar para deducir la existencia de una enfermedad (p. ej., cáncer) detectando la presencia de compuestos asociados con el estado de enfermedad o para monitorizar la contaminación detectando compuestos característicos de la descarga de determinados contaminantes. También son posibles otras numerosas aplicaciones.

En general, la invención se refiere a una baliza de aptámero como se define en la reivindicación 1 que se une a una molécula diana de ácido no nucleico y que incluye un oligonucleótido que incluye una porción de bucle, un primer segmento y un segundo segmento complementario del primer segmento, en el que el primero y el segundo segmentos forman una porción de tallo cuando se hibridan; una región de unión formada por el oligonucleótido y configurada para unirse a la molécula diana de ácido no nucleico; un primer resto indicador, por ejemplo un fluoróforo, unido al primer segmento; y un segundo resto indicador, por ejemplo un inactivador químico, unido al segundo segmento, en el que los restos indicadores primero y segundo interaccionan para producir una señal detectable cuando la distancia entre ellos se modifica; en el que la unión de la molécula diana a la región de unión rompe los enlaces de los pares de bases en la porción de tallo, lo que produce un cambio en la conformación de la baliza de aptámero que separa los segmentos primero y segundo de modo que alteran la distancia entre los restos indicadores primero y segundo y producen una señal detectable.

Un cambio conformacional en una baliza de aptámero es una alteración en la estructura secundaria y/o terciaria del oligonucleótido que forma la baliza de aptámero. Un cambio conformacional típicamente tiene como resultado la adición y/o deleción de las interacciones de apareamiento... [Seguir leyendo]

1. Una baliza de aptámero que se une a una molécula diana de ácido no nucleico específica, comprendiendo la baliza de aptámero un oligonucleótido que comprende una porción de bucle, un primer segmento, y un segundo segmento 5 complementario al primer segmento, en el que los primero y segundo segmentos conectados por la parte de bucle forman una porción de tallo en ausencia de cualquier ácido no nucleico específico diana;

en el que una porción del oligonucleótido comprende una región de unión que tiene una conformación secundaria o terciaria que cambia a una conformación secundaria o terciaria diferente tras la unión a la molécula de ácido no nucleico diana específica; y

en el que un primer resto indicador está unido al primer segmento; y un segundo resto indicador está unido al segundo segmento, en el que los primero y segundo restos indicadores interaccionan para producir una señal detectable cuando se cambia la distancia entre ellos;

en el que la unión específica de la molécula diana específica a la región de unión rompe los enlaces de los pares de bases en la porción de tallo, produciendo un cambio de conformación de la baliza de aptámero que separa los primero y segundo segmentos, alterando de este modo la distancia entre los primero y segundo restos indicadores y produciendo una señal detectable.

2. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que el primer resto indicador es un fluoróforo y el segundo resto indicador es un inactivador químico, de modo que el inactivador inactiva el fluoróforo cuando los segmentos primero y segundo hibridan para formar la porción de tallo y en el que la unión de una molécula diana a la región de unión rompe las uniones de los pares de bases en la porción de tallo, lo que hace que los segmentos primero y segundo se separen y el fluoróforo se separe del grupo químico, de modo que finaliza la inactivación y se permite que el fluoróforo emita una fluorescencia detectable.

3. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que la región de unión se localiza dentro de la porción de bucle, la porción de tallo o al menos parcialmente en ambas, dentro del oligonucleótido.

4. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que el primero y el segundo restos indicadores son una enzima y un correspondiente ligando.

5. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que el primero y el segundo segmentos comprenden 4, 5, 6, o 7 nucleótidos cada uno.

6. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que la molécula diana específica es trombina.

7. Una baliza de aptámero que se une a una molécula diana de ácido no nucleico específica como se representa en las figuras 4A y 4B, comprendiendo la baliza de aptámero

un oligonucleótido que comprende un primer segmento, un segundo segmento, y un tercer segmento, en el que los primero y segundo segmentos pueden formar enlaces de pares de bases para formar un complejo cuando la baliza de aptámero no se une a la molécula diana específica;

en el que el segundo segmento comprende una región de unión para la molécula diana de ácido no nucleico específica; y

un primer resto indicador unido al comienzo del primer segmento;

un segundo resto indicador unido al extremo del tercer segmento, en el que los primero y segundo restos indicadores interaccionan para producir una señal detectable cuando se cambia la distancia entre ellos;

en el que tras la unión específica de la molécula diana específica de ácido no nucleico a la región de unión se rompen los enlaces de los pares de bases entre los segmentos primero y segundo y se forman enlaces de pares de bases entre los segmentos primero y tercer, de modo que se produce un cambio de conformación de la baliza de aptámero que altera la distancia entre los restos indicadores primero y segundo, produciendo de este modo una señal detectable.

8. Una baliza de aptámero que se une a una molécula diana de ácido no nucleico específica como se representa en las figuras 4C y 4D, comprendiendo la baliza de aptámero un oligonucleótido que comprende un primer segmento, un segundo segmento, un tercer segmento y un cuarto segmento, en el que segmentos primero y segundo así como los segmentos tercero y cuarto pueden formar enlaces de pares de bases para formar un complejo cuando la baliza de aptámero no se une a la 50 molécula diana específica; en el que el primer segmento comprende una región de unión para la molécula diana de ácido no nucleico específica;

un primer resto indicador unido al comienzo del primer segmento adyacente al segundo segmento; y

un segundo resto indicador unido al extremo del tercer segmento adyacente al cuatro segmento, en el que los 5 restos indicadores primero y segundo interaccionan para producir una señal detectable cuando se cambia la distancia entre ellos;

en el que tras la unión específica de la molécula diana específica de ácido no nucleico a la región de unión se rompen los enlaces de los pares de bases entre los segmentos primero y segundo así como los segmentos tercero y cuarto y se forman enlaces de pares de bases entre los segmentos segundo y tercero, de modo que se produce un cambio de conformación de la baliza de aptámero que altera la distancia entre los restos indicadores primero y segundo, produciendo de este modo una señal detectable.

9. La baliza de aptámero de la reivindicación 7 u 8, en la que el primer resto indicador es un resto absorbente de energía y el segundo resto indicador puede ser un resto emisor de fluorescencia, de forma que cuando los restos indicadores primero y segundo están lo bastante cercados, el resto absorbente permite una transferencia de energía entre los restos, de modo que permite que el resto emisor emita fluorescencia; y en el que la unión de una molécula diana a la región hace que los segmentos primero y segundo hibriden.

10. La baliza de aptámero de la reivindicación 7, en la que el complejo es un dúplex.

11. Un dispositivo para detectar de forma simultánea la presencia de una pluralidad de moléculas diana de ácido no nucleico diferentes en una muestra, comprendiendo el dispositivo:

un soporte sólido; y

una pluralidad de diferentes balizas de aptámero de la reivindicación 1 unidas al soporte, teniendo cada baliza de aptámero un primer extremo unido al soporte, y una región de unión que se une a una molécula diana de ácido no nucleico, en el que las regiones de unión de las diferentes balizas de aptámero se unen a diferentes moléculas diana.

12. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que el soporte sólido comprende una superficie de cristal a la que los primeros extremos de las balizas de aptámero están unidas covalentemente.

13. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que el soporte comprende una superficie plana y las balizas de aptámero se distribuyen sobre la superficie plana en una matriz bidimensional.

14. El dispositivo de la reivindicación 13, en el que los puntos de balizas de aptámero idénticas se localizan en 30 diferentes puntos en la matriz bidimensional.

15. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que la región de unión de al menos una de las balizas de aptámero está configurada para unirse a una molécula diana de ácido no nucleico específica seleccionada del grupo que consiste en una proteína, un esteroide y una molécula inorgánica.

16. El dispositivo de la reivindicación 11, en el que las balizas de aptámero comprenden ARN, ADN, ARN 35 modificado, ADN modificado o una combinación de los mismos.

17. El dispositivo de la reivindicación 16, en el que uno de los restos indicadores comprende un fluoróforo.

18. Un procedimiento para detectar la presencia o ausencia de una o más moléculas diana específicas diferentes en una muestra, comprendiendo el procedimiento:

la obtención de una pluralidad de balizas de aptámero de la reivindicación 1;

poner en contacto la muestra con las balizas de aptámero, de tal manera que cualquier molécula diana específicas en la muestra pueda unirse a las correspondientes regiones de unión de las balizas de aptámero; y

detectar la presencia de moléculas diana específicos unidas a las balizas de aptámero.

19. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que las balizas de aptámero están en un líquido.

20. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que las balizas de aptámero están unidas a un soporte sólido.

21. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el soporte sólido es una partícula.

22. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que el soporte sólido es una placa.

23. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que las balizas de aptámero emiten radiación de fluorescencia cuando son excitadas por ondas evanescentes.

24. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que diferentes puntos, comprendiendo cada punto una pluralidad de balizas de aptámero idénticas se distribuyen sobre el soporte sólido en una disposición

predeterminada, y el procedimiento comprende además comparar un patrón de fluorescencia de la muestra con patrones de fluorescencia conocidos.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que la etapa de comparación incluye el uso de un programa informático, dispuesto en un medio legible por ordenador, incluyendo el programa de ordenador instrucciones para hacer que un procesador:

compare el patrón de fluorescencia de la muestra con una biblioteca de patrones de fluorescencia conocidos; y

seleccione la combinación de patrones de fluorescencia conocidos que más se acerque el patrón de fluorescencia de la muestra.

26. El procedimiento de la reivindicación 18, en el que la etapa de detección incluye detectar un cambio en las frecuencias de emisión de Raman de una baliza de aptámeros, cambio causado por la unión de una molécula diana específica a la baliza de aptámero.

27. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que el soporte sólido comprende una película de metal a la que están unidos los aptámeros y la etapa de detección incluye detectar un cambio en la condición resonante de los plasmones superficiales en la película metálica causada por la unión de una molécula diana específica a una baliza de aptámero.

28. Un dispositivo para detectar la presencia de una molécula diana específica en una muestra, comprendiendo el dispositivo:

un soporte sólido; y

una pluralidad de diferentes balizas de aptámero de la reivindicación 1 unidas al soporte, teniendo cada baliza de aptámero un primer extremo unido al soporte, y una región de unión que se une a un enantiómero específico de la molécula diana o un sitio de unión específico de la molécula diana, en el que las regiones de unión de las diferentes balizas de aptámero se unen a diferentes enantiómeros de la molécula diana o a diferentes sitios de unión de la molécula diana.

29. El dispositivo de la reivindicación 28, en el que la molécula diana específica comprende un antígeno, y los 30 diferentes sitios de unión comprenden diferentes epítopos del antígeno.

30. El dispositivo de la reivindicación 28, en el que la molécula diana específica comprende una bacteria, y los diferentes sitios de unión comprenden diferentes proteínas de la superficie de las bacterias.

31. Un sistema para detectar de forma simultánea la presencia de una pluralidad de moléculas diana de ácido no nucleico diferentes en una muestra, comprendiendo el sistema:

una pluralidad de diferentes balizas de aptámero de la reivindicación 1 unidas al soporte, teniendo cada baliza de aptámero un primer extremo unido al soporte, una región de unión que se une a una molécula diana de ácido no nucleico específica, las regiones de unión de diferentes aptámeros de unión a diferentes moléculas diana específicas; y

un sistema de detección que detecta la presencia de moléculas diana específicas unidas a balizas de 40 aptámero, comprendiendo el sistema de detección una fuente de radiación y un detector.

32. El sistema de la reivindicación 31, en el que la fuente de radiación comprende un láser.

33. El sistema de la reivindicación 31, que comprende además un analizador para determinar la presencia de moléculas diana en la muestra en base a los resultados del detector, en el que el analizador comprende un procesador informático programado para:

comparar la salida del detector con una biblioteca de salidas conocidas correspondientes a la exposición de muestras de composición conocida a las balizas de aptámero; y

seleccionar una combinación de resultados conocidos que más se acerque a los resultados del ensayo.

34. El sistema de la reivindicación 31, en el que las balizas de aptámero están en un líquido.

35. El sistema de la reivindicación 31, en el que las balizas de aptámero están unidas a un soporte sólido.

36. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido comprende ARN o ARN modificado.

37. La baliza de aptámero de la reivindicación 1, en la que el oligonucleótido comprende ADN o ADN modificado.

38. Un sistema para detectar de forma simultánea la presencia de una pluralidad de moléculas diana de ácido no nucleico diferentes en una muestra, comprendiendo el sistema:

una pluralidad de diferentes especies de balizas de aptámero de la reivindicación 1, en el que cada especie de balizas de aptámero tiene un grupo indicador diferente, una región de unión que se une a una molécula diana de ácido no nucleico específica y en el que las regiones de unión de diferentes aptámeros se unen a diferentes moléculas diana específicas; y

un sistema de detección que detecta la presencia de moléculas diana específicas unidas a balizas de 10 aptámero, siendo el sistema de detección capaz e detectar los diferentes grupos indicadores.