Reactivos y procedimientos para mejorar la reproducibilidad y reducir el cebado defectuoso en la amplificación por PCR.

Reactivo que no contribuye a la fluorescencia de fondo pero que puede evitar por lo menos una manifestación del cebado defectuoso en una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),

para producir por lo menos un producto de ADN amplificado cuando es añadido a una concentración no superior a 650 nM a una mezcla de amplificación por PCR que incluye 1,25 unidades de una ADN polimerasa termoestable por 25 μl de mezcla de reacción, siendo dicho reactivo un oligonucleótido no extensible que presenta un extremo 3' y una estructura de tallo-bucle, que no es una sonda de hibridación para dicho por lo menos un producto de ADN amplificado, que presenta un tallo que comprende una región de doble cadena que presenta una longitud superior a seis nucleótidos, y un extremo alejado del bucle que comprende un nucleótido 3' y un nucleótido 5', presentando dicho tallo una temperatura de fusión del tallo (Tm) calculada inferior a 94ºC, en el que:

(a) el extremo 3' no es extensible por dicha ADN polimerasa, y

(b) dicho extremo de tallo resulta estabilizado por unos medios no fluorescentes seleccionados de entre el grupo constituido por grupos no fluorescentes inhibidores de fluoróforo unidos covalentemente a los nucleótidos 3' y 5' de dicho extremo del tallo y nucleótidos no naturales que se unen más fuertemente que un híbrido ADN-ADN natural al extremo del tallo.

Reactivos y procedimientos para mejorar la reproducibilidad y reducir el cebado defectuoso en la amplificación por PCR.

Campo técnico La presente invención se refiere a reacciones de amplificación de ácidos nucleicos y ensayos que utilizan la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , incluyendo ensayos homogéneos, tanto en tiempo real como de punto final.

Antecedentes La amplificación de ácidos nucleicos mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es bien conocida, al igual que los ensayos que incluyen la amplificación por PCR (ver las patentes US nº 4.683.202, nº 4.683.195 y nº

4.965.188 y, de manera general, PCR PROTOCOLS, A Guide to Methods and Applications, Innis et al., editores, Academic Press (San Diego, CA, USA, 1990) . También son bien conocidos los ensayos de PCR homogéneos que no requieren lavado para eliminar los reactivos o sondas detectoras no unidas y que, de esta manera, pueden llevarse a cabo sin abrir recipientes de reacción de amplificación. Entre los ensayos de PCR homogéneos se incluyen tanto ensayos de punto final, en los que se detecta el producto amplificado al final de la reacción de amplificación, como los ensayos en tiempo real, en los que el producto amplificado se detecta durante parte o la totalidad de los ciclos térmicos a medida que se produce la reacción (ver las patentes US nº 5.994.056, nº 5.487.972, nº 5.925.517 y nº 6.150.097) .

Las reacciones de amplificación por PCR generalmente se diseñan para que sean simétricas, es decir, para que generen amplicones de doble cadena mediante la utilización de un cebador directo y un cebador inverso que son "correspondientes", es decir, que presentan temperaturas de fusión de máxima similitud y que se añaden a la reacción en concentraciones equimolares. Una técnica de uso limitado para preparar ADN de una cadena directamente en una reacción de PCR es la "PCR asimétrica" (Gyllensten y Erlich, "Generation of Single-Stranded DNA by the Polymerase Chain Reactions and Its Application to Direct Sequencing of the HLA-DQA Locus", Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85:7652-7656, 1988, y patente US nº 5.066.584) . La PCR asimétrica difiere de la PCR simétrica en que uno de los cebadores se añade en una cantidad limitante, típicamente 1 a 20 por ciento de la concentración del otro cebador.

Más recientemente, los presentes inventores han desarrollado un método de amplificación por PCR no simétrico conocido como PCR "lineal tras exponencial" o, abreviadamente, "LATE-PCR" (ver Sánchez et al., PNAS 101:19331938, 2004; Pierce et al., PNAS 102:8609-8614, 2005, y solicitud publicada de patente internacional WO nº 03/054233 (3 de julio de 2003) , que se incorpora como referencia en la presente memoria en su totalidad) . La LATE-PCR considera las temperaturas de fusión reales de los cebadores de PCR al inicio de la amplificación, denominadas Tm[0]; Tm[0], las cuales pueden determinarse empíricamente, lo que resulta necesario en el caso de que se utilicen nucleótidos no naturales, o calcularse según el método del "vecino más próximo" (Santa Lucia J., PNAS (USA) 95:1460-1465, 1998; y Allawi H.T. y Santa Lucia J., Biochem. 36:10581-10594, 1997) , utilizando ajustes de la concentración salina. En el trabajo de los presentes inventores se utilizó una concentración de sal monovalente de 0, 07 M.

Una característica no deseable de las amplificaciones por PCR, que se alivia en el caso de la LATE-PCR, es la dispersión entre réplicas. Tras la etapa exponencial de la amplificación, las réplicas de amplificación sometidas a seguimiento en tiempo real son divergentes y alcanzan niveles de saturación diferentes. La dispersión indica que las réplicas no presentan la misma cinética de reacción, reduciendo la precisión. Éste es un problema general de los ensayos de PCR, aunque concretamente de los ensayos de punto final y de los ensayos que dependen de la pendiente de la señal en la etapa lineal.

Otro problema significativo de las amplificaciones por PCR es el cebado defectuoso, que los presentes inventores consideran que se manifiesta en forma de por lo menos tres tipos: tipo 1, cebado defectuoso que se produce durante la preparación de mezclas de reacción previamente al inicio de la amplificación; tipo 2, cebado defectuoso que se produce durante la amplificación en el caso de que las temperaturas del ciclado incluyan cualquiera temperatura significativamente inferior a la temperatura de fusión de un cebador, y tipo 3, el cebado defectuoso que se produce en las últimas etapas de una amplificación por PCR que se continúa tras alcanzar una concentración elevada de amplicón. Se han utilizado varios enfoques para resolver el primer tipo de cebado defectuoso. Un enfoque es modificar la polimerasa químicamente, de manera que ésta se encuentre inactiva hasta alcanzar una temperatura elevada, tal como 95º C (ver las patentes US nº 5.677.152 y nº 5.773.258) . Otro enfoque consiste en unir un anticuerpo a la polimerasa para inhibirla hasta que la reacción alcance una temperatura elevada, tal como 95º C, a fin de desnaturalizar irreversiblemente el anticuerpo (ver la patente US nº 5.338.671) . Todavía otro enfoque consiste en incluir un aptámero en la mezcla de reacción (ver Doug y Jayasena, J. Mol. Biol. 264:268-278, 1996, y la patente US nº 6.020.130) . Un aptámero es un oligonucleótido monocatenario de aproximadamente 30 nucleótidos de longitud que se une a una polimerasa y que inhibe su capacidad de extender un extremo 3' a temperaturas bajas. Los aptámeros no resultan desnaturalizados irreversiblemente a 95º C, una temperatura máxima típica en un ciclo de PCR. Kainz et al., Biotechniques 28:278-282, 2000, han informado de que la adición a mezclas de reacción de PCR de fragmentos de ADN de doble cadena que presentan longitudes de entre 16 y 21 nucleótidos en determinadas cantidades inhibe las polimerasas a temperaturas inferiores a las temperaturas de extensión de PCR típicas y suprime la síntesis de productos no específicos. Los fragmentos de ADN resultan desnaturalizados irreversiblemente durante el ciclado de la PCR. La compañía Eppendorf-5 Prime, Inc. comercializa un ligando propietario que se afirma se une a la polimerasa Taq de un modo dependiente de la temperatura e inhibe su unión al ADN de doble cadena a temperaturas inferiores a aproximadamente 50º C. A pesar de estos muchos intentos, el cebado defectuoso sigue siendo un problema en las amplificaciones por PCR.

El documento WO 01/02559 enseña la utilización de oligonucleótidos inhibidores que pueden presentar una estructura de horquilla y que pueden utilizarse para bloquear la síntesis de ácidos nucleicos no específicos. La patente US nº 6.183.967 B1 enseña la utilización de un ligando de ácidos nucleicos que puede presentar una estructura de tallo-bucle y que puede impedir que una mezcla de PCR amplifique ADN de fondo.

Otra manifestación del cebado defectuoso durante la amplificación por PCR es la formación y amplificación de dímeros de cebadores. En este fenómeno un cebador se hibrida con el otro cebador o a sí mismo y después experimenta la extensión del extremo 3', generando un pequeño amplicón de doble cadena, que después puede amplificarse adicionalmente o multimerizarse y amplificarse adicionalmente. La formación de dímero de cebadores puede producirse en ausencia de diana.

El análisis cuantitativo de las amplificaciones por PCR ha resultado posible gracias a los métodos de detección en tiempo real, ya que el ciclo de PCR en el que la señal fluorescente resulta visible a un nivel superior al ciclo umbral o CT de las reacciones es indicativo de las concentraciones diana iniciales. Los análisis de punto final en el mejor de los casos son semicuantitativos, debido en parte a la dispersión entre réplicas observada fuera del intervalo de amplificación exponencial de la reacción de amplificación. El análisis electroforético de los amplicones de doble cadena es semicuantitativo y puede utilizar cebadores marcados fluorescentemente. El análisis de punto final con sondas marcadas fluorescentemente, sondas discriminantes de alelos o sondas tolerantes al desapareamiento, también son semicuantitativos en el mejor de los casos. Mediante la reducción de la dispersión y generación de producto de una sola cadena, la LATE-PCR proporciona una mejora significativa de los análisis de punto final, aunque la dispersión entre réplicas con frecuencia no consigue eliminarse por completo, llevando a una detección multiplex cuantitativa menos precisa de lo deseado.

Un aspecto de la presente invención es una clase de aditivos reactivos que mejoran la... [Seguir leyendo]

1. Reactivo que no contribuye a la fluorescencia de fondo pero que puede evitar por lo menos una manifestación del cebado defectuoso en una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , para producir por lo menos un producto de ADN amplificado cuando es añadido a una concentración no superior a 650 nM a una mezcla de amplificación por PCR que incluye 1, 25 unidades de una ADN polimerasa termoestable por 25 μl de mezcla de reacción, siendo dicho reactivo un oligonucleótido no extensible que presenta un extremo 3' y una estructura de tallo-bucle, que no es una sonda de hibridación para dicho por lo menos un producto de ADN amplificado, que presenta un tallo que comprende una región de doble cadena que presenta una longitud superior a seis nucleótidos, y un extremo alejado del bucle que comprende un nucleótido 3' y un nucleótido 5', presentando dicho tallo una temperatura de fusión del tallo (Tm) calculada inferior a 94º C, en el que:

(a) el extremo 3' no es extensible por dicha ADN polimerasa, y

(b) dicho extremo de tallo resulta estabilizado por unos medios no fluorescentes seleccionados de entre el grupo constituido por grupos no fluorescentes inhibidores de fluoróforo unidos covalentemente a los nucleótidos 3' y 5' de dicho extremo del tallo y nucleótidos no naturales que se unen más fuertemente que un híbrido ADN-ADN natural al extremo del tallo.

2. Reactivo según la reivindicación 1, en el que el bucle es (i) un oligonucleótido que comprende por lo menos tres nucleótidos; o (ii) un conector químico no nucleotídico, opcionalmente en el que el conector químico es un puente metileno con 3 a 6 átomos de carbono.

3. Reactivo según la reivindicación 1 ó 2, en el que el tallo comprende una región de doble cadena de 9 a 12 pares de bases.

4. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tallo presenta extremos romos y no contiene desapareamientos internos.

5. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el tallo presenta una temperatura de fusión (Tm) calculada en un intervalo seleccionado de entre el grupo constituido por 72º C a 85º C y 50º C a 71º C.

6. Reactivo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los medios de estabilización de tallo son parejas d.

2. O-metilnucleótidos.

7. Kit de reactivos para llevar a cabo una amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende una ADN polimerasa termoestable, por lo menos una pareja de cebadores de PCR, dNTP y por lo menos un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que opcionalmente el kit comprende además unos reactivos para el aislamiento de ácidos nucleicos.

8. Conjunto de oligonucleótidos para llevar a cabo una amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que comprende por lo menos una pareja de cebadores de PCR y por lo menos un reactivo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que opcionalmente el conjunto de oligonucleótidos incluye además por lo menos una sonda marcada fluorescentemente que hibrida con el producto amplificado definido por dicha por lo menos una pareja de cebadores de PCR.

9. Conjunto según la reivindicación 8, en el que: (i) por lo menos una pareja de cebadores incluye un cebador limitante y un cebador en exceso en una proporción apropiada para llevar a cabo una amplificación por PCR lineal tras exponencial (LATE-PCR) ; y/o (ii) dicho producto amplificado es monocatenario.