Métodos para analizar secuencias de ácido nucleico monocatenario.

Un método de ensayo homogéneo para analizar al menos una única secuencia diana de ácido nucleico monocatenario en una muestra,

que comprende

a) proporcionar una muestra que contiene dicha al menos una secuencia diana de ácido nucleico y múltiples conjuntos de sondas distinguibles de manera detectable, donde las sondas de los conjuntos de sondas se hibridan de manera adyacente de forma que cada nucleótido de la secuencia diana está cubierto, y donde cada conjunto de sondas comprende

(i) una sonda marcada con un inactivador no fluorescente, y

(ii) una sonda marcada con un resto fluorescente;

donde tras la hibridación de dicha sonda marcada con un resto fluorescente con dicha al menos una secuencia diana en dicha muestra en ausencia de dicha sonda marcada con un inactivador no fluorescente, dicho resto fluorescente emite una señal sobre el fondo,

donde, si ambas sondas de un conjunto de sondas se hibridan con dicha al menos secuencia diana, el inactivador no fluorescente inactiva la señal procedente del resto fluorescente; y

b) analizar la hibridación de dichos conjuntos de sondas con dicha al menos una secuencia diana en función de la temperatura.

Métodos para analizar secuencias de ácido nucleico monocatenario Campo

Se proporcionan en el presente documento métodos de detección mediante fluorescencia de secuencias de ácidos nucleicos.

Antecedente

Se conoce bien la detección homogénea de secuencias de ácidos nucleicos. La detección puede incluir un colorante, por ejemplo Verde SYBR, que fluoresce en presencia de un producto de la reacción de amplificación bicatenario de una sonda de hibridación de oligonucleótidos marcada fluorescentemente. Para las sondas de hibridación, "detección homogénea" significa una detección que no requiere la separación entre las sondas unidas (hibridadas a dianas) de las sondas no unidas. Entre las sondas adecuadas para la detección homogénea están las sondas lineales marcadas en un extremo con un fluoróforo y en el otro extremo con un inactivador cuyo espectro de absorción solapa sustancialmente el espectro de emisión del fluoróforo para la inactivación de FRET (las sondas 5' exonucleasa descritas en, por ejemplo, Livak et al. (1995) PCR Methods Appl. 4:357-362), las sondas en horquilla marcadas en un extremo con un fluoróforo y en el otro extremo con un inactivador (sondas de baliza molecular descritas en, por ejemplo, Tyagi et al. (1996) Nature Biotechnology 14:303-308), sondas bicatenarias que tienen un fluoróforo en una hebra y un inactivador en la otra hebra (sondas yin-yang descritas en, por ejemplo, Li y col., (2002) Nucí. Acids Res. 30, N° 2 e5), sondas lineales que tienen un fluoróforo que absorbe emisión de un colorante fluorescente y la reemlte a una longitud de onda más larga (sondas descritas en, por ejemplo, la solicitud de patente publicada de los Estados Unidos US2002/0110450), y parejas de sondas lineales, una marcada con un fluoróforo donante y una marcada con un fluoróforo aceptor que se hibrida cerca de una hebra diana de tal manera que sus marcas interactúan mediante FRET (parejas de sondas FRET descritas en, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.140.054). Los métodos de detección incluyen métodos para detectar secuencias de ácidos nucleicos en dianas monocatenarlas, dianas bicatenarias, o ambas.

Las secuencias de ácidos nucleicos diana adecuadas para el sondaje pueden en algunos casos obtenerse directamente mediante el aislamiento y la purificación del ácido nucleico en una muestra. En otros casos se requiere la amplificación del ácido nucleico. Los métodos de amplificación para uso en la detección homogénea incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), incluyendo la PCR simétrica, la PCR asimétrica y la PCR-LATE, cualquiera de las cuales se puede combinar con la transcripción inversa amplificando las secuencias de ARN, NASBA, SDA, amplificación en círculo rodante. Los métodos para detectar la amplificación pueden basarse en la fluorescencia debido a la sonda de hibridación, o se pueden basar en la digestión de sondas hibridadas durante la amplificación, por ejemplo, el método para detectar la amplificación de la 5' nucleasa. Si una muestra contiene o se amplifica para que contenga dianas bicatenarias, por ejemplo, el producto de amplificación de una reacción de la PCR simétrica, pero se desean dianas monocatenarias, la separación entre las hebras positivas y negativas se puede llevar a cabo por métodos conocidos, por ejemplo, marcando un cebador con biotina y separando las hebras del producto que contienen biotina de las otras hebras mediante captura en una superficie que contiene avidina, que a continuación se lava.

Determinadas sondas fluorescentes útiles para la detección homogénea contienen una hebra marcada con fluoróforo que emite una señal detectable cuando se hibrida con su secuencia diana en una muestra. Por ejemplo, una sonda de baliza molecular es monocatenaria y emite una señal fluorescente detectable tras la hibridación. Una sonda ResonSense® es también monocatenaria y señala solo cuando se hibrida siempre que la muestra contenga un colorante, generalmente un colorante SYBR, que estimula las sondas hibridadas mediante FRET cuando se estimula el colorante. Las sondas yin-yang son sondas bicatenarias inactivadas que incluyen una hebra marcada con fluoróforo que emite una señal detectable cuando se hibridan con su diana. Las parejas de sondas FRET, por otra parte, son parejas de sondas que emiten una señal fluorescente detectable cuando ambas sondas de la pareja se hibridan con sus secuencias diana. Algunos ensayos de amplificación, de forma notable el ensayo de la 5' nucleasa, Incluye la generación de señales producidas por el corte de la sonda para generar fragmentos de sonda fluorescentes más bien que simplemente la hibridación de la sonda.

Se pueden construir determinadas sondas que generan una señal tras la hibridación de tal manera que sean "específicas de alelo", esto es, que se hibriden solamente a las secuencias diana perfectamente complementarias, o que sean tolerantes al emparejamiento incorrecto, esto es, que se hibriden tanto a las secuencias diana que son perfectamente complementarias pero que contienen uno o más emparejamientos incorrectos. Las sondas de baliza molecular específicas de alelo tienen secuencias de sonda relativamente cortas, generalmente bucles monocatenarlos de no más de 25 nucleótidos de longitud con tallos en horquilla de 4-6 nucleótidos de longitud, y son útiles para detectar, por ejemplo, polimorfismos de nucleótidos únicos. Marras et al. (1999) Genetic Analysis: Blomolecular Englneerlng 14: 151-156, describe un ensayo de PCR simétrica en tiempo real que incluye en la mezcla de reacción cuatro balizas moleculares que tienen secuencias de sondas de 16 nucleótidos de longitud y tallos de 5 nucleótidos, donde cada sonda tiene un color diferente, esto es, incluye un fluoróforo que es distinguible

de forma detectable por su longitud de onda de emisión, y una secuencia de sonda que difiere de las otras en un único nucleótido. La muestra se analiza tras cada ciclo de la PCR para detectar qué color surge e identificar por tanto cuál de las cuatro posibles secuencias diana perfectamente complementarias de una de las sondas está presente en una muestra. Las sondas de baliza molecular tolerantes al emparejamiento incorrecto tienen secuencias de sonda más largas, son generalmente bucles monocatenarios de hasta 50 o incluso 60 nucleótidos con tallos en horquilla mantenidos con 4-7 nucleótidos. Tyagi et al. Patente europea N° 1230387, describe una amplificación de la PCR simétrica y un ensayo de detección homogéneo que utiliza un conjunto de cuatro sondas de baliza molecular tolerantes para el emparejamiento incorrecto coloreadas de manera diferente que tienen secuencias de sonda diferentes de 40-45 nucleótidos de longitud y tallos de 5-7 nucleótidos de longitud, que se hibridan competitivamente con, y cuestionan por tanto, una secuencia hipervariable de 42 nucleótidos de longitud de genes del ARN micobacteriano de 16S para determinar cuál de las ocho especies de micobacterias está presente en una muestra. La muestra se analiza determinando la relación entre las intensidades de los fluoróforos a una o más temperaturas para identificar la especie que está presente. El-Hajj et al (2009) J. Clin. Microbiology 47:1190-1198, describe la amplificación de la PCR-LATE y un ensayo de detección homogéneo que utiliza de manera similar un conjunto de cuatro sondas de baliza molecular tolerantes para el emparejamiento incorrecto coloreadas de manera diferente que tienen secuencias de sonda diferentes de 36-39 nucleótidos de longitud y tallos de 5-7 nucleótidos de longitud que se hibridan competitivamente a, y cuestionan por tanto, una secuencia hipervariable de 39 nucleótidos de longitud de genes del ARN de 16S micobacteriano para determinar cuál de las veintisiete especies de micobacterias está presente en una muestra. Cada una de las cuatro sondas es una "sonda consenso", esto es, tiene un bucle monocatenario complementario de múltiples especies pero que no es perfectamente complementario de ninguna de ellas. El ADN genómico de alguna de las 27 especies diferentes se amplificó por separado, se determinó la Tf de cada sonda mediante el análisis de fusión posterior a la amplificación, y se tabularon los datos. Para analizar una muestra que contenía especies desconocidas, la muestra se amplificó y se analizó como anteriormente. Las Tf de las cuatro sondas se compararon con los resultados tabulados para identificar las especies presentes en la muestra.

Se han usado múltiples sondas, tanto tolerantes al emparejamiento incorrecto como específicas de alelo, para interrogar múltiples secuencias diana así como secuencias diana más largas que una única sonda específica de alelo. Se han usado sondas de baliza molecular específicas de alelo más largas que una secuencia de sonda... [Seguir leyendo]

1. Un método de ensayo homogéneo para analizar al menos una única secuencia diana de ácido nucleico monocatenarlo en una muestra, que comprende

a) proporcionar una muestra que contiene dicha al menos una secuencia diana de ácido nucleico y múltiples conjuntos de sondas distinguibles de manera detectable, donde las sondas de los conjuntos de sondas se hibridan de manera adyacente de forma que cada nucleótido de la secuencia diana está cubierto, y donde cada conjunto de sondas comprende

(i) una sonda marcada con un inactivador no fluorescente, y (¡i) una sonda marcada con un resto fluorescente;

donde tras la hibridación de dicha sonda marcada con un resto fluorescente con dicha al menos una secuencia diana en dicha muestra en ausencia de dicha sonda marcada con un inactivador no fluorescente, dicho resto fluorescente emite una señal sobre el fondo,

donde, si ambas sondas de un conjunto de sondas se hibridan con dicha al menos secuencia diana, el inactivador no fluorescente inactiva la señal procedente del resto fluorescente; y

b) analizar la hibridación de dichos conjuntos de sondas con dicha al menos una secuencia diana en función de la temperatura.

2. El método de la reivindicación 1 donde dicho análisis comprende el análisis de un efecto sobre la señal de cada sonda marcada con un resto fluorescente debido a su sonda asociada marcada con un inactivador no fluorescente.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2 donde cada una de dichas sondas marcadas con un resto fluorescente tiene una sonda asociada separada marcada con un inactivador no fluorescente.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 donde cada sonda marcada con un resto fluorescente está también marcada con un inactivador no fluorescente.

5. El método de la reivindicación 3 donde dos conjuntos de sondas comprenden: una primera sonda que tiene un resto fluorescente en un extremo y un ¡nactlvador no fluorescente en el otro extremo, donde dicho resto fluorescente de la primera sonda interactúa con una segunda sonda marcada con un inactivador no fluorescente y un inactivador no fluorescente de la primera sonda Interactúa con una tercera sonda marcada con un resto fluorescente.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 donde la temperatura de fusión de la sonda marcada con un resto fluorescente en un conjunto es mayor que la temperatura de fusión de su sonda asociada marcada con un inactivador no fluorescente.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 donde la concentración de dicha al menos una diana es menor que la concentración de al menos una sonda en al menos un conjunto para esta secuencia diana.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, 6 y 7 donde la concentración de la sonda marcada con un resto fluorescente de al menos un conjunto de sondas es menor que la concentración de su sonda asociada marcada con un inactivador no fluorescente.

9. El método de la reivindicación 1 donde dichos restos fluorescentes y dichos restos inactivadores no fluorescentes ¡nteractúan mediante FRET.

10. El método de la reivindicación 3 donde dos conjuntos de sondas comprenden: una sonda marcada en cada extremo con restos inactivadores no fluorescentes y dos sondas marcadas con restos fluorescentes, donde la sonda marcada en cada extremo con restos inactivadores no fluorescentes interactúa con cada una de las sondas marcadas con restos fluorescentes tras la hibridación a dicha secuencia diana.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 donde la técnica de hibridación incluye generar al menos una curva de fusión o al menos una curva de hibridación y comparar dicha al menos una curva de fusión o al menos una curva de hibridación con una curva de fusión o una curva de hibridación previamente establecida.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11 donde proporcionar la muestra que contiene dicha al menos una secuencia diana en forma monocatenaria comprende amplificar dicha al menos una secuencia diana de ácido nucleico.

13. El método de la reivindicación 12 donde dicha amplificación es mediante una amplificación PCR-LATE.

14. El método de la reivindicación 13 donde las sondas de al menos un conjunto de sondas tienen temperaturas de fusión por debajo de la temperatura de hibridación de al menos un cebador de la reacción de amplificación.

15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-14 donde dicha al menos una secuencia diana es una variante de una secuencia variable que está flanqueada por secuencias que están al menos relativamente conservadas, donde la etapa de proporcionar dicha al menos una secuencia diana incluye una reacción de amplificación que genera amplicones monocatenarios utilizando no más de unas pocas parejas de cebadores que se hibridan a dichas 5 secuencias flanqueantes, donde dicho al menos un conjunto de sondas incluye al menos dos conjuntos de sondas, y donde para dicha variante la temperatura de fusión de al menos una sonda de señalización es mayor que la temperatura de fusión de su sonda inactivadora asociada.