Entrecruzamiento de monómeros de superóxido dismutasa.

Un análogo de superóxido dismutasa estabilizado, en donde dicho análogo tiene una estructura terciaria y comprende un primer monómero de SOD1,

un segundo monómero de SOD1, y un entrecruzador; dicho entrecruzador comprende un brazo espaciador con una longitud desde 3 Å hasta 15 Å; en donde dicho primer monómero de SOD1 comprende una primera cisteína en una primera posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje, y dicho segundo monómero de SOD1 comprende una segunda cisteína en una segunda posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje; y la primera cisteína está covalentemente unida a la segunda cisteína por el entrecruzador.

Entrecruzamiento de monómeros de superóxido dismutasa Antecedentes de la invención

Se necesitan enfoques innovadores para combatir las enfermedades neurodegenerativas, entre las más serias de las cuales está la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), un trastorno caracterizado por la muerte de las neuronas motoras tanto superiores como inferiores y por una supervivencia mediana de 3-5 años tras el diagnóstico. El único fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de ELA, riluzol, tiene en el mejor de los casos, un efecto moderado sobre la supervivencia y calidad de vida de los pacientes (1-3). De los más de cincuenta ensayos clínicos para ELA que Implican todo desde compuestos antiinflamatorios a metales a antloxldantes, no se han Identificado ningún fármaco eficaz. Notablemente, a pesar de la evidencia creciente de que la agregación y pérdida de la estabilidad proteica son parte de la etiología de ELAf, no se ha llevado ningún Inhibidor o chaperona farmacológica a ensayos clínicos. El único ensayo que conocemos que se dirige específicamente a SOD1 es un ensayo clínico de fase I en marcha, pequeño que Implica oligonucleótidos antisentido. De forma Interesante, los ensayos clínicos de ELA han implicado en general las mismas estrategias y muchos de los mismos compuestos usados en ensayos de Parklnson, aunque probablemente no compartan rutas de enfermedad comunes.

Mientras que las causas de las enfermedades neurodegenerativas esporádicas permanecen un misterio, las mutaciones que causan las formas familiares de muchas de estas enfermedades (por ejemplo, Alzhelmer, Parklnson y ELA) se conocen. Por ejemplo, las mutaciones en el gen que codifica la Cu/Zn superóxido dismutasa (SOD1) son responsables de ~2% de los casos de ELA familiar (ELAf) y el 2% de toda la ELA. Dos de tales mutaciones son G93A, que mantiene actividad enzimática similar al tipo salvaje, y G85R deficiente en metal, que es esencialmente inactiva. Se han invocado las modificaciones postraduccionales de proteínas implicadas en enfermedades familiares en la etiología de las correspondientes enfermedades esporádicas, por ejemplo, modificación de alfa-sinucleína y parkina en Parkinson, una modificación de beta y tau en Alzheimer, y modificación de TDP43 y SOD1 en ELA. Sin embargo, la esperanza es que estrategias para tratar las enfermedades familiares se puedan traducir a al menos un subconjunto de enfermedades esporádicas.

Tanto la herencia dominante de SOD1 mutante como la falta de síntomas en ratones deficientes sugieren una "función de ganancia tóxica" como opuesto a una pérdida defunción. La propensión a la agregación y la pérdida de de estabilidad de SOD1 son factores de riesgo sinérgicos para la gravedad de la enfermedad en pacientes de ELAf, y se ha sugerido que una propiedad común de las variantes de ELAf in vitro e in vivo es su propensión a agregar. Una hipótesis predominante para el mecanismo de la toxicidad de variantes de ELAf-SOD1 implica la desestabilización y disociación de dímeros a monómeros, que después nuclean la formación de agregados de orden superior. En efecto, las proteínas variantes tal como la SOD1 G85R usada en este estudio, se encuentran como monómeros in vivo. Un número de modificaciones, incluyendo pérdida de Cu o Zn, corte del disulfuro intramolecular nativo, oxidación y mutación asociada a ELAf, predisponen SOD1 a la disociación de dímeros. Las estructuras cristalinas de rayos X de tanto A4V, como a un nivel menor I113T; el análisis del doble híbrido en levaduras de H46R, A4V y H48Q; la disociación de G85R, G93R, E1G e I113T por caotropos; y las simulaciones de dinámica molecular son todas consistentes con esta hipótesis. Además de la hipótesis que la desestabilización de dimeros produce agregación, otra hipótesis para la agregación es que SOD1 ELAf recién traducida produce variantes que no dimerizan nunca debido a la falta de la formación de disulfuro ¡ntrasubunldad, deficiencia en metal, etc., que produce monómeros inestables. Consistente con esto, la estabilización de la ¡nterfase del dímero de SOD1 por subunidades de anclaje, o a través del uso de moléculas pequeñas, puede prevenir la agregación de proteínas.

El documento EP18388 A1 proporciona una composición de superóxido dismutasa lecitinizada (PC-SOD) divulgada como útil como un material fármaco y un proceso para su producción.

El documento US4818698 (correspondiente a DE362858 A1) tiene como su objeto la provisión de polipéptidos análogos de SOD-h (SOD de origen humano) novedosos que sean útiles como medicamentos.

El Intercambio tlol-disulfuro se puede explorar como un enfoque representativo para anclar un dímero de SOD1 estable. El Intercambio tiol-disulfuro es adecuado para la Investigación como una estrategia terapéutica y de hecho se sabe que se produce in vivo en Cys111 de SOD1, lo que produce la unión de SOD1 al tripéptido glutatlón (GSH). Esto sugiere que los residuos de Cys111 en la ¡nterfase del dímero de SOD1 son una potencia diana para agentes terapéuticos. Además, Cys111 de SOD1 humana es uno de al menos dos residuos (el otro es W32 de SOD1) que modulan la toxicidad de las mutaciones de ELAf. Por ejemplo, el mutante C111S aumenta la estabilidad de SOD1 y revierte la cltotoxicidad y agregación de las mutaciones de SOD1 de ELAf C6F, C146R, G93A, A4V, y H46R. La modificación química de Cys111 por alquilación también aumenta la estabilidad de SOD1.

Compendio de la invención

Un aspecto de la invención es un análogo de superóxido dismutasa estabilizado, en donde dicho análogo tiene una estructura terciaria y comprende un primer monómero de SOD1, un segundo monómero de SOD1, y un

entrecruzador; dicho entrecruzador comprende un brazo espaciador con una longitud desde 3 A hasta 15 Á; en donde dicho primer monómero de SOD1 comprende una primera cisterna en una primera posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje, y dicho segundo monómero comprende una segunda cisterna en una segunda posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje; y la primera cisterna está covalentemente unida a la segunda cisterna por el entrecruzador. Otro aspecto de la invención es un método de producir un análogo de superóxido dismutasa (SOD1) estabilizado, que comprende el paso de hacer reaccionar un primer monómero de SOD1, un segundo monómero de SOD1, y un entrecruzador, formando de esta manera dicho análogo. Un sitio representativo eficaz para este entrecruzamiento es la posición 111 de cada monómero. La invención también incluye un método de producir el análogo de SOD1, en donde una primera cisteína de un primer monómero de SOD1 y una segunda cisteína de un segundo monómero de SOD1 y una segunda cisteína de un segundo monómero de SOD1 se unen por un entrecruzador. Otro aspecto de la invención es un análogo de SOD1 estabilizado de la invención para su uso en el tratamiento o profilaxis para una enfermedad neurodegenerativa. Una enfermedad neurobiológica representativa para la que esta invención puede tener una eficacia significativa es esclerosis lateral amiotrófica. También se divulga una composición farmacéutica, que comprende un análogo de SOD1, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra el sitio del entrecruzamiento entre subunidades en cisteína 111 en SOD1. Los residuos de cisteína 111 en monómeros de SOD1 enfrentados se muestran en cada extremo.

La figura 2 muestra un diagrama de bloques que resume ciertos métodos usados en experimentos de entrecruzamiento.

La figura 3 muestra los resultados de análisis de inmunotransferencia de ciertos experimentos de entrecruzamiento de SOD1. (A) Entrecruzamiento con diferentes entrecruzadores de maleimida y vinilsulfona. SOD1 se entrecruzó con una concentración 1:1 o 1:3 de entrecruzador respecto a proteína. Cada uno de los entrecruzadores de maleimida entrecruzó SDOI produciendo la formación de dímeros. TMEA, un entrecruzador trifuncional, parece ser el entrecruzador más eficaz. HBVS, una vinilsulfona, no parece entrecruzar SOD1. (B) Entrecruzamiento con DTME de SOD1. SOD1 se entrecruzó con DTME, que contiene un enlace disulfuro en su región enlazadora, y se corrió en un SDS PAGE en presencia o ausencia de agente reductor. El agente reductor redujo el entrecruzador devolviendo el dímero a su forma monomérica.

La figura 4 muestra los resultados del análisis de MALDI-TOF MS de SOD1 entrecruzada. (A) Entrecruzamiento de SOD1 de tipo salvaje. (B) entrecruzamiento de G93A. Tanto SOD1 WT como G93A se entrecruzan usando entrecruzadores de maleimida como se ve por el aumento en dímero observado en el análisis de MALDI-TOF MS de SOD1 entrecruzada.

La figura 5 muestra... [Seguir leyendo]

Un análogo de superóxido dismutasa estabilizado, en donde dicho análogo tiene una estructura terciaria y comprende un primer monómero de SOD1, un segundo monómero de SOD1, y un entrecruzador; dicho entrecruzador comprende un brazo espaciador con una longitud desde 3 A hasta 15 A; en donde dicho primer monómero de SOD1 comprende una primera cisterna en una primera posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje, y dicho segundo monómero de SOD1 comprende una segunda cisterna en una segunda posición correspondiente a la posición 111 de SOD1 humana de tipo salvaje; y la primera cisterna está covalentemente unida a la segunda cisterna por el entrecruzador.

El análogo de la reivindicación 1, en donde aplica uno cualquiera o más de los siguientes,

a) la estructura terciara es sustancialmente la misma que la enzima superóxido dismutasa humana de tipo salvaje;

b) la primer cisterna y la segunda cisterna ocupan la misma posición numerada;

c) la primer cisterna y la segunda cisterna ocupan distintas posiciones numeradas;

d) la primera cisteína está en la posición 111; y

e) la segunda cisteína está en la posición 111.

El análogo de las reivindicaciones 1 o 2, en donde la identidad de secuencia de dicho primer monómero de SOD1 y dicho segundo monómero de SOD1 es mayor de o igual al 85%; y/o dicho primer monómero de SOD1 y dicho segundo monómero de SOD1 tienen la misma secuencia de aminoácidos.

El análogo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el primer monómero de SOD1 de dicho análogo es la secuencia humana de tipo salvaje o es un monómero de SOD1 humana que comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en G93A, G85R, D9A, A4V, E1G, H46R, C6G e I113T; y/o

el segundo monómero de SOD1 de dicho análogo es la secuencia humana de tipo salvaje o es un monómero de SOD1 humana que comprende una mutación seleccionada del grupo que consiste en G93A, G85R, D9A, A4V, E1G, H46R, C6G e I113T.

El análogo de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicho análogo retiene al menos el 9% de actividad de la enzima superóxido dismutasa humana de tipo salvaje hasta una temperatura de 75 grados C.

El análogo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde aplica cualquiera de los siguientes,

a) la temperatura de desnaturalización de dicho análogo aumenta de 1 grados C hasta 6 grados C comparada con su dímero no entrecruzado;

b) la temperatura de desnaturalización de dicho análogo aumenta de 2 grados C hasta 4 grados C comparada con su dímero no entrecruzado;

c) la temperatura de desnaturalización de dicho análogo aumenta de 15 grados C hasta 25 grados C comparada con su dímero no entrecruzado;

d) la temperatura de desnaturalización de dicho análogo aumenta de 3 grados C hasta 5 grados C comparada con su dímero no entrecruzado;

e) la temperatura de desnaturalización de dicho análogo aumenta en 2 grados C comparada con su dímero no entrecruzado; y

f) la temperatura de desnaturalización de dicho análogo aumenta en 4 grados C comparada con su dímero no entrecruzado.

El análogo de superóxido dismutasa estabilizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde opcionalmente,

a)

i) el entrecruzador se selecciona del grupo que consiste en DTME, TMEA, BMDB, BM(PEG)2, BMB y BMOE; o

ii) el entrecruzador se selecciona del grupo que consiste en organomercuriales, maleimidas, vinilsulfonas y algentes alquilantes; y/o

b) aplica cualquiera de los siguientes,

a) el entrecruzador comprende un brazo espaciador con una longitud desde 7 angstroms hasta 11 angstroms;

b) el entrecruzador comprende un brazo espaciador con una longitud de 9 angstroms.

8. Una composición farmacéutica que comprende un análogo de SOD1 estabilizado de la reivindicación 1; y un soporte farmacéuticamente aceptable.

9. Un método de producir un análogo de superóxido dismutasa (SOD1) estabilizado según la reivindicación 1

que comprende,

a) el paso de hacer reaccionar un primer monómero de SOD1, un segundo monómero de SOD1 y un entrecruzador, formando de esta manera dicho análogo; o

b) el paso de unir mediante un entrecruzador una primera cisterna de un primer monómero de SOD1 con

una segunda cisterna de un segundo monómero de SOD1.

1. El método de la reivindicación 9, en donde aplica uno cualquiera o más de los siguientes,

a) el método comprende además el paso de sustituir un aminoácido natural del primer monómero de SOD1

con la primera cisterna; y

b) el método comprende además el paso de sustituir un aminoácido natural del segundo monómero de SOD1 con la segunda cisteína.

11. Un análogo de SOD1 estabilizado de cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para su uso en el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa o en la profilaxis de una enfermedad neurodegenerativa, en donde opcionalmente,

) la enfermedad neurodegenerativa es esclerosis lateral amlotróflca; y/o

i) el mamífero es un primate, bovino, ovino, equino, porcino, roedor, felino, o canino; y/o

ii) el mamífero es un ser humano.