Ensayo de detección de diana multiplex.

Un método para analizar secuencias diana de ácido nucleico de cadena sencilla en una muestra,

que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende una primera secuencia diana de ácido nucleico de cadena sencilla y al menos una segunda secuencia diana de ácido nucleico de cadena sencilla, con reactivos de detección en un tubo único, comprendiendo dichos reactivos de detección conjuntos de pares de sondas para cada una de las secuencias diana, comprendiendo cada uno de dichos pares de sondas:

(i) al menos una sonda amortiguadora marcada con un amortiguador no fluorescente, y

(ii) al menos una sonda señalizadora marcada con un colorante fluorescente,

en donde la sonda señalizadora es una sonda de autoamortiguación que comprende un amortiguador no fluorescente para reducir la señal del fluoróforo cuando la sonda señalizadora no se hibrida con una diana y en donde la señal ruido es emitida desde la sonda señalizadora cuando la sonda señalizadora no se une a la secuencia diana,

en donde la señal ruido anterior es emitida desde la sonda señalizadora cuando la sonda señalizadora se une a la secuencia diana pero la sonda amortiguadora no se une a la secuencia diana,

en donde la sonda señalizadora y la sonda amortiguadora hibridan de manera adyacente sobre la secuencia diana de manera que la señal de la sonda señalizadora es amortiguada por el amortiguador no fluorescente cuando tanto la sonda señalizadora como la sonda amortiguadora se unen a la secuencia diana;

en donde las sondas señalizadoras de cada uno de los conjuntos de sondas están marcados con colorantes fluorescentes del mismo color;

en donde el intervalo de temperaturas en el que el conjunto de sondas para dicha primera diana se unen a la primera secuencia de ácido nucleico de cadena sencilla se solapa con el intervalo de temperaturas en el que el conjunto de sondas para dicha segunda diana se unen a la segunda secuencia diana de ácido nucleico de cadena sencilla.

(b) analizar la señal de las sondas señalizadoras en función de la temperatura, en donde la sonda señalizadora y la sonda amortiguadora de un primer conjunto de sondas tienen temperaturas de fusión para la hibridación con una primera secuencia diana en el intervalo de 10-75 °C, por lo que la primera secuencia diana es una parte del gen promotor inhA de M. tuberculosis y, en donde un primer conjunto de los pares de sondas comprende una sonda señalizadora que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 19 y una sonda amortiguadora que tiene una secuencia de la SEQ ID NO: 20.