Método de construcción de un soporte de transporte génico.

Primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium,

y que tiene entre el promotor y el terminador un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5'-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.

Método de construcción de un soporte de transporte génico

Campo técnico La presente invención se refiere a un método de construcción de un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa que es útil como agente terapéutico para un tumor sólido. Además, la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico construido mediante el método.

Antecedentes de la técnica En los últimos años, se han estudiado de diversas maneras, terapias para tumor maligno usando un portador de suministro génico. Por ejemplo, con respecto a una bacteria anaerobia Clostridium, se ha propuesto un método de transporte de un gen a un sitio tumoral usando una bacteria transformada (véanse por ejemplo, los documentos de patente 1 y 2) .

Asimismo, con respecto a la bacteria anaerobia Bifidobacterium, se ha esperado que su transformante se aplique como vector para probióticos o vector para una vacuna oral para una enfermedad infecciosa (véase por ejemplo, el documento de patente 3) . Además, con respecto a Bifidobacterium longum, se ha sugerido su aplicación al tratamiento de un tumor sólido, porque esta bacteria se acumula en un tumor sólido hipóxico tras una administración sistémica (véanse por ejemplo, los documentos no de patente 1 y 2) .

Además, los presentes inventores han confirmado que, mediante transformación con un plásmido recombinante pBLES100-S-eCD que porta codA de Escherichia coli fusionado con un promotor de una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de Bifidobacterium longum, citosina desaminasa (EC3.5.4.1; denominada “CD” a continuación en el presente documento) que es una enzima que convierte 5-fluorocitosina (denominada “5-FC” a continuación en el presente documento) como profármaco (precursor) de 5-fluorouracilo (denominado “5-FU” a continuación en el presente documento) que tiene actividad antitumoral, en 5-fluorouracilo, puede expresarse en un microorganismo recombinante, y han notificado que puede esperarse que el microorganismo recombinante, por ejemplo, Bifidobacterium longum recombinante, se aplique a terapias de enzima-profármaco (véanse por ejemplo, el documento de patente 4 y los documentos no de patente 3 y 4) . Para aplicar este microorganismo modificado genéticamente que expresa CD a terapias de enzima-profármaco, se requiere además que el microorganismo tenga resistencia a 5-FU a una concentración al menos eficaz para una actividad antitumoral, que se convierte a partir de 5-FC mediante CD. Por tanto, los presentes inventores han desarrollado y notificado un método de construcción de una bacteria resistente a 5-FU que expresa CD de este tipo (véase por ejemplo, el documento de patente 5) . Por otro lado, con respecto a esta CD, el documento no de patente 5 ha notificado que cuando se añadía una mutación que sustituía ácido aspártico por alanina en el aminoácido 314 (correspondiente a la posición 315 en SEQ ID NO: 28 de la presente invención) de CD a ADN que codifica para CD en Escherichia coli, la CD mutante tenía la actividad de CD de convertir 5-FC en 5-FU que era aproximadamente 2, 2 veces (50/23) superior a la de CD de tipo natural antes de la mutación (véase la sección del medio de la tabla 1 en documento no de patente 5) .

Se han notificado diversos métodos de transformación en bacterias recombinantes usados en el tratamiento de tumor maligno. En los documentos descritos anteriormente, se han notificado sus respectivos métodos de preparación de una bacteria transformada.

Por ejemplo, el documento de patente 3 ha notificado un método de transformación que comprende las etapas de: producir un plásmido lanzadera que se replica de manera mutua tanto en una especie de Bifidobacterium como Escherichia coli, usando un plásmido derivado de una especie de Bifidobacterium y un plásmido derivado de Escherichia coli; y producir un vector recombinante ligando un gen de interés que codifica para una proteína de interés al plásmido lanzadera, en el que la especie de Bifidobacterium usada en la producción del plásmido lanzadera se usa como célula huésped que va a transformarse con el vector recombinante producido.

Además, por ejemplo, con respecto a un método de preparación de un plásmido lanzadera pBLES100 usado en la construcción del plásmido recombinante pBLES100-S-eCD, se ha notificado un método de preparación que comprende construir este plásmido lanzadera a partir de pTB6 de Bifidobacterium longum BK51 y pBR322 de Escherichia coli (véase por ejemplo, el documento no de patente 6) .

Además, se han propuesto métodos de preparación de los plásmidos pAV001 y pBRASTA101, que pueden transformar Bifidobacterium longum con una eficacia de 100 veces o superior a la del plásmido lanzadera pBLES100 (véase por ejemplo, el documento no de patente 7) .

Por tanto, se han notificado diversos métodos de construcción de un portador de suministro génico útil para el tratamiento de tumor maligno. Sin embargo, todos estos métodos han especificado microorganismos, plásmidos o

similares usados en la transformación y han usado técnicas de transformación habituales como método de transformación por sí mismo. Además, estos métodos están destinados a construir un microorganismo transformado que puede expresar por sí mismo, en una zona afectada diana, un gen de interés, por ejemplo, un gen para expresar una proteína que tiene una actividad antitumoral o una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral. Ningún documento ha notificado hasta la fecha un método de construcción que esté destinado a mejorar la actividad o eficacia de expresión de una proteína expresada por sí misma a partir del gen de interés.

Documento de patente 1: Patente estadounidense nº 6416754

Documento de patente 2: Patente estadounidense nº 6652849

Documento de patente 3: Publicación nacional de solicitud de patente internacional nº 2004-519236

Documento de patente 4: Patente japonesa abierta a consulta por el público nº 2002-97144

Documento de patente 5: WO 2006/109619

Documento no de patente 1: Yazawa et al. Cancer Gene Ther., 7, 269-274 (2000)

Documento no de patente 2: Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat., 66, 165-170 (2001)

Documento no de patente 3: Nakamura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 66, 2362-2366 (2002)

Documento no de patente 4: Fujimori et al., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 5, 200-203 (2002)

Documento no de patente 5: Sheri et al., Protein Engineering, Design and Selection, 17 (8) : 625-633 (2004)

Documento no de patente 6: Matsumura et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 61, 1211-1212 (1997)

Documento no de patente 7: Tanaka et al., Biosci Biotechnol Biochem.; 69 (2) : 422-425 (2005)

Descripción de la invención Objeto que va a solucionarse mediante la invención Todos los métodos notificados anteriormente de construcción de un portador de suministro génico útil para el tratamiento de tumor maligno están destinados a construir una bacteria transformada que puede expresar por sí misma, en una zona afectada diana, un gen de interés, por ejemplo, un gen para expresar una proteína que tiene una actividad antitumoral o una proteína que tiene la actividad de convertir un precursor de sustancia antitumoral en una sustancia antitumoral. Ningún documento ha notificado hasta la fecha un método de construcción que esté destinado a mejorar la actividad o eficacia de expresión de una proteína expresada por sí misma a partir del gen de interés.

Sin embargo, para terapias que usan un portador de suministro génico, la actividad y eficacia de expresión de una proteína expresada por un gen introducido en un microorganismo transformado son cuestiones importantes. Se requiere naturalmente que la proteína expresada por un gen en el microorganismo transformado tenga la misma actividad que la de una proteína expresada por un gen portado por el microorganismo de tipo natural original y, además, debe expresarse a un nivel igual a o superior al del gen portado por el microorganismo original.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un método de construcción eficaz de un portador de suministro génico que tiene la actividad y eficacia de expresión favorables de una proteína expresada por un gen introducido mediante transformación. Además, un objeto de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico construido mediante el método... [Seguir leyendo]

1. Primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium, y que tiene entre el promotor

y el terminador un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.

2. Primer fragmento de ADN según la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta uno cualquiera del 1493er al 1535º nucleótido en SEQ ID NO: 15.

3. Primer fragmento de ADN según la reivindicación 1 ó 2, en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er aminoácido hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

4. Primer fragmento de ADN según la reivindicación 3, en el que el péptido que consiste en una secuencia de

aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29 es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta el 9º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

5. Método de construcción de un portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio y que puede expresar citosina desaminasa, que comprende las etapas de:

(1) preparar un plásmido de fusión que tiene un fragmento de un plásmido de una bacteria del género Bifidobacterium y un fragmento de un plásmido de Escherichia coli;

(2) incorporar un primer fragmento de ADN que comprende un promotor y un terminador de un gen que codifica para una proteína de unión a ADN similar a histona derivado de una bacteria del género Bifidobacterium al plásmido de fusión;

(3) incorporar, entre el promotor y el terminador, un ADN en el que se fusiona un segundo fragmento de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona en el lado 5’-terminal de un ADN mutado que codifica para citosina desaminasa para preparar un vector de expresión; y

(4) transformar un microorganismo anaerobio con el vector de expresión, en el que el ADN mutado que codifica para citosina desaminasa es (a) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene la metionina de iniciación excluida o (b) un ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada como SEQ ID NO: 28 que tiene el ácido aspártico en la 315ª posición sustituido por alanina y la metionina de iniciación excluida.

6. Método de construcción de un portador de suministro génico según la reivindicación 5, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es una secuencia de nucleótidos desde el 1482º hasta uno cualquiera del 1493er al 1535º nucleótido en SEQ ID NO: 15.

7. Método de construcción de un portador de suministro génico según la reivindicación 5 ó 6, en el que el péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en el extremo N-terminal de la proteína de unión a ADN similar a histona es un péptido que consiste en una secuencia de aminoácidos desde el 1er hasta uno cualquiera del 4º al 18º aminoácido en SEQ ID NO: 29.

8. Portador de suministro génico que consiste en un microorganismo anaerobio que puede crecer en un tejido tumoral en un entorno anaerobio, construyéndose el portador de suministro génico mediante un método de construcción según una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7.

9. Portador de suministro génico según la reivindicación 8, en el que la bacteria anaerobia es una bacteria del género Bifidobacterium.

10. Portador de suministro génico según la reivindicación 9, en el que la bacteria del género Bifidobacterium es cualquier bacteria del género Bifidobacterium seleccionada de Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium animalis, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium thermophilum, Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium breve y Bifidobacterium longum.

11. Composición farmacéutica que comprende un portador de suministro génico según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.