Nitrilasas con actividad mejorada.

Nitrilasa que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos según la ID Sec.

Nº: 2, que en comparación con la nitrilasa según la ID Sec. Nº: 2

i) presenta un incremento de al menos un 15% de la actividad en la reacción de un nitrilo para producir el ácido carboxílico correspondiente, seleccionándose el nitrilo preferentemente entre el grupo consistente en 2-metilglutaronitrilo, 1-(cianometil)ciclohexano-1-carbonitrilo y benzonitrilo; y

ii) presenta al menos una sustitución de aminoácido seleccionada entre el grupo consistente en:

a) sustitución de Leu en la posición que corresponde a la posición 9 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

b) sustitución de Val en la posición que corresponde a la posición 63 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr;

c) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 70 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr y Val;

d) sustitución de Arg en la posición que corresponde a la posición 94 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

e) sustitución de Leu en la posición que corresponde a la posición 194 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

f) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 208 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr y Val;

g) sustitución de Cys en la posición que corresponde a la posición 250 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

h) sustitución de Val en la posición que corresponde a la posición 305 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, 30 His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr; y

i) sustitución de Asp en la posición que corresponde a la posición 308 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.

Nitrilasas con actividad mejorada La invención se refiere a nitrilasas de alta actividad y estabilidad a la temperatura. Las nitrilasas se utilizan para la síntesis de ácidos carboxílicos a partir de los nitrilos correspondientes. En comparación con los catalizadores químicos, se caracterizan por unas condiciones de reacción más suaves y se utilizan preferentemente para hidrólisis 5 regioselectivas y estereoselectivas, para las que hasta la fecha no existe una alternativa química. La utilización de nitrilasas para la síntesis de ácidos carboxílicos se ha descrito en la literatura (R. Singh, R. Sharma, N. Tewari, y D. S. Rawat. Chem Biodivers. 3 (12) :1279-1287, 2006) .

Para realizar un proceso de síntesis económico, preferentemente se utilizan nitrilasas que presentan una alta actividad específica y una larga estabilidad de proceso. Así, es posible utilizar una menor cantidad de catalizador. En la mayoría 10 de los casos, una alta estabilidad de proceso está en correlación con una mayor estabilidad frente a la temperatura de las enzimas. Además, una enzima con una mayor estabilidad frente a la temperatura tiene la ventaja de permitir un desarrollo eficaz del proceso también a altas temperaturas, lo que con frecuencia conduce a unos tiempos de reacción todavía más cortos.

Ya se han aislado nitrilasas de diferentes microorganismos, por ejemplo de los géneros Aspergillus, Arthrobacter, 15 Geobacillus, Fusarium, Norcadia, Rhodococcus, Alcaligenes, Acidovorax, Acinetobacter, Bradyrhizopium, Pseudomonas, Pyrococcus, Bacillus. (R. N. Thuku, D. Brady, M. J. Benedik, y B. T. Sewell. Journal of Applied Microbiology 106 (3) :703-727, 2009; C. OReilly y P. D. Turner. Journal of Applied Microbiology 95 (6) :1161-1174, 2003.)

La nitrilasa de Acidovorax facilis se describió por vez primera en el documento US 6.870.038. La expresión heteróloga de la enzima en E. coli condujo a un aumento de la actividad pro biomasa aproximadamente en un factor 3 (US 20 6.870.038) .

Una posibilidad para mejorar enzimas es la utilización de ingeniería enzimática. El objetivo de la ingeniería enzimática es desarrollar variantes de una enzima inicial con mejores propiedades.

En S. Wu, A. J. Fogiel, K. L. Petrillo, E. C. Hann, L. J. Mersinger, R. DiCosimo, D. P. OKeefe, A. Ben Bassat, y M. S. Payne. Biotechnol Bioeng. 97 (4) :689-693, 2007, y en el documento US 7148051 se describen mutaciones para 25 aumentar la actividad de una nitrilasa en la producción de ácido 3-hidroxivaleriánico. Un cambio de los aminoácidos en las posiciones T219 a A o C y en F168 a K, V o L condujo a un aumento de la actividad. Otras mutaciones de la nitrilasa de Acidovorax facilis se describen en S. Wu, A. J. Fogiel, K. L. Petrillo, R. E. Jackson, K. N. Parker, R. DiCosimo, A. Ben Bassat, D. P. OKeefe, y M. S. Payne. Biotechnol.Bioeng. 99 (3) :717-720, 2008, y en el documento US 7198927. En dichos documentos se describe un aumento de la actividad para la síntesis de ácido glicólico a partir de glicolonitrilo 30 para las mutaciones individuales F168 a V, K, M, T, L201 a N, Q, K. H, S, T, A, G, y para algunas variantes con combinaciones de estas mutaciones individuales. En la variante F168V se comprobó además una mayor estabilidad a la temperatura de la suspensión celular enzimática en comparación con la célula que contiene la enzima natural. En este contexto se analizó la estabilidad frente a la temperatura del biocatalizador dentro de la célula intacta de E. coli, que en general influye positivamente en la estabilidad proteínica. 35

El documento US 2009/111158 describe un procedimiento para la producción de catalizadores enzimáticos con actividad nitrilasa para la hidrólisis de glicolonitrilo con el fin de producir ácido glicólico.

El documento WO 2006/069114 se refiere a un procedimiento para la producción de ácido glicólico a partir de formaldehído y ácido cianhídrico.

El documento US 2010/240109 describe un procedimiento para mejorar la actividad específica de catalizadores 40 enzimáticos con actividad nitrilasa en la reacción de glicolonitrilo para obtener ácido glicólico en medio acuoso.

El documento WO 2006/069110 describe diversos métodos para la producción enzimática de ácido glicólico a partir de glicolonitrilo.

K.T. Barglow y col., Biochemistr y 2008, 47, 13514-13525 dan a conocer investigaciones funcionales y estructurales para el reconocimiento molecular en caso de enzimas de la familia de las nitrilasas. 45

El documento EP 1 767 624 describe proteínas con actividad nitrilohidratasa mejorada y resistencia al calor mejorada.

El documento de L. Martinkova y col., Curr Op in Chem Biol, tomo 14, nº 2, 2010, 130-137, se refiere a investigaciones de biotransformaciones con ayuda de nitrilasas.

G. DeSantis y col., J Am Chem Soc 125 (83) , 2003, 11476-11477, dan a conocer la producción de nitrilasas productivas, sumamente enantioselectivas, con ayuda de mutagénesis por saturación (GSSM) . 50

El documento de S. Chauvan y col., Appl Microbiol Biotech, tomo 61, nº 2, 2003, 118-122, se refiere a la purificación, clonación, secuenciación y sobreexpresión de una nitrilasa alifática regioselectiva a partir de Acidovorax facilis 72W en E. coli.

Los documentos US 2009/111162 A1 y US 2009/325250 A1 describen un procedimiento para mejorar la actividad específica de un catalizador enzimático con actividad nitrilasa en la transformación de glicolonitrilo en ácido glicólico 5 bajo condiciones de reacción acuosas.

La invención tiene como objetivo proporcionar una nitrilasa con propiedades mejoradas. En comparación con las nitrilasas conocidas, esta nitrilasa se debería caracterizar por una mayor actividad para reducir la cantidad utilizada de enzima o acortar los tiempos de reacción. Además, la nitrilasa debería presentar una mayor estabilidad, en particular una mayor estabilidad frente a la temperatura, para posibilitar una mayor vida útil durante la reacción catalizada por la 10 misma. De este modo, la reacción se podría realizar con una menor cantidad de enzima durante más tiempo o con una alta velocidad de reacción a temperatura elevada.

Este objetivo se resuelve mediante el objeto de las reivindicaciones.

Sorprendentemente se han descubierto posiciones de aminoácidos en la secuencia proteínica de la nitrilasa de Acidovorax facilis (ID Sec. Nº 2) que mediante sustitución (cambio) de los aminoácidos en posiciones individuales y/o 15 mediante combinación de varias posiciones presenta una actividad elevada con diferentes sustratos y/o una mayor estabilidad frente a la temperatura. Este efecto también se observa sorprendentemente en las enzimas aisladas que se encuentran fuera de células intactas. En particular, sorprendentemente se han podido identificar posiciones de aminoácidos en las que mutaciones individuales conducen simultáneamente a una mejora de la actividad y de la estabilidad de la enzima. Del mismo modo, sorprendentemente también se han podido identificar posiciones de 20 aminoácidos cuya combinación conduce a una mejora sinérgica de las propiedades relevantes de la enzima (posibilidad de combinación de las mutaciones individuales) .

Gracias al aumento de la actividad es posible reducir la cantidad de enzima a utilizar o acortar los tiempos de reacción. Ambas posibilidades influyen positivamente en los costes de la síntesis y, en consecuencia, tienen importancia económica. La estabilidad mejorada, en especial la estabilidad frente a la temperatura de la enzima, posibilita una vida 25 útil más larga durante la reacción. Así, la reacción se puede llevar a cabo con una cantidad menor de enzima durante más tiempo o la reacción se puede llevar a cabo a una alta velocidad de reacción a temperatura elevada. Las dos medidas conducen a reducir los costes de la síntesis.

En el gen de la nitrilasa de Acidovorax facilis se han podido identificar posiciones de aminoácidos que conducen a un aumento de la actividad y la estabilidad de la enzima. Esto se ha podido demostrar para las posiciones L9, V63, T70, 30 R94, F168, L194, T208, C250, V305 y D308. Sorprendentemente, las sustituciones han conducido tanto a un aumento de la actividad en las posiciones L9, V63, T70, F168, T208, C250 como a un aumento de la estabilidad frente a la temperatura en las posiciones L9, V63, T70, R94, F168, C250, V305. Sorprendentemente se ha comprobado que es posible combinar sustituciones en las posiciones individuales, lográndose un aumento adicional de la actividad y la estabilidad frente a la temperatura. 35

Definiciones Enzima inicial El concepto "enzima inicial" se refiere a la nitrilasa de Acidovorax facilis según la ID Sec. 2, que es codificada mediante la secuencia de nucleótidos correspondiente... [Seguir leyendo]

1. Nitrilasa que incluye una secuencia de aminoácidos con al menos un 60% de identidad con respecto a la secuencia de aminoácidos según la ID Sec. Nº: 2, que en comparación con la nitrilasa según la ID Sec. Nº: 2

i) presenta un incremento de al menos un 15% de la actividad en la reacción de un nitrilo para producir el ácido carboxílico correspondiente, seleccionándose el nitrilo preferentemente entre el grupo consistente en 5 2-metilglutaronitrilo, 1- (cianometil) ciclohexano-1-carbonitrilo y benzonitrilo; y

ii) presenta al menos una sustitución de aminoácido seleccionada entre el grupo consistente en:

a) sustitución de Leu en la posición que corresponde a la posición 9 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val; 10

b) sustitución de Val en la posición que corresponde a la posición 63 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr;

c) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 70 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, 15 His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr y Val;

d) sustitución de Arg en la posición que corresponde a la posición 94 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

e) sustitución de Leu en la posición que corresponde a la posición 194 de ID Sec. Nº: 2 por un 20 aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

f) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 208 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr y Val; 25

g) sustitución de Cys en la posición que corresponde a la posición 250 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

h) sustitución de Val en la posición que corresponde a la posición 305 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, 30 His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Tyr; y i) sustitución de Asp en la posición que corresponde a la posición 308 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val.

2. Nitrilasa según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta al menos una sustitución de aminoácido 35 seleccionada entre el grupo consistente en:

a) sustitución de Leu en la posición que corresponde a la posición 9 de ID Sec. Nº: 2 por Lys, Glu, Ile o Arg;

b) sustitución de Val en la posición que corresponde a la posición 63 de ID Sec. Nº: 2 por Pro, Ile, Met o Thr;

c) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 70 de ID Sec. Nº: 2 por Ile, Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, Gly, Leu, Met, Asn, Pro, Gln, Ser, Tyr; Arg o Val; 40

d) sustitución de Arg en la posición que corresponde a la posición 94 de ID Sec. Nº: 2 por Gln, Glu, Phe, Gly, Lys, Met, Asn, Pro, Ala, Gly, His, Ile, Leu, Ser, Thr, Val o Tyr;

e) sustitución de en la posición que corresponde a la posición 194 de ID Sec. Nº: 2 por Tyr, Cys, Lys o Met;

f) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 208 de ID Sec. Nº: 2 por Ala, Gly o Leu;

g) sustitución de Cys en la posición que corresponde a la posición 250 de ID Sec. Nº: 2 por Gly, Ala, Phe, Lys, 45 Met, Arg, Ser, Thr, Tyr o His;

h) sustitución de Val en la posición que corresponde a la posición 305 de ID Sec. Nº: 2 por Leu o Met; y i) sustitución de Asp en la posición que corresponde a la posición 308 de ID Sec. Nº: 2 por Asn o Trp.

3. Nitrilasa según la reivindicación 1 o 2, caracterizada porque presenta al menos dos sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo consistente en a) , b) , c) , d) , e) , f) , g) , h) e i) . 50

4. Nitrilasa según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque presenta al menos tres sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre el grupo consistente en a) , b) , c) , d) , e) , f) , g) , h) e i) .

5. Nitrilasa según una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque adicionalmente presenta al menos otra sustitución de aminoácido seleccionada entre el grupo consistente en:

j) sustitución de Tyr en la posición que corresponde a la posición 65 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido 55 seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp y Val;

k) sustitución de Phe en la posición que corresponde a la posición 168 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

l) sustitución de Phe en la posición que corresponde a la posición 174 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, 5 Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val;

m) sustitución de Ile en la posición que corresponde a la posición 201 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr y Val; y n) sustitución de Thr en la posición que corresponde a la posición 210 de ID Sec. Nº: 2 por un aminoácido 10 seleccionado entre el grupo consistente en Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Trp, Tyr y Val.

6. Nitrilasa según una de las reivindicaciones anteriores, que, después de un tratamiento térmico en el que la actividad de la nitrilasa según ID Sec. Nº: 2 se reduce al menos en un 40%, posee una actividad residual al menos un 10% mayor en comparación con la nitrilasa según ID Sec. Nº: 2 en lo que respecta a la reacción de 15 un nitrilo para obtener el ácido carboxílico correspondiente, seleccionándose el nitrilo entre el grupo consistente en 2-metilglutaronitrilo, 1- (cianometil) ciclohexano-1-carbonitrilo y benzonitrilo.

7. Nitrilasa que incluye una secuencia de aminoácidos que presenta una identidad de más de un 95% con respecto a la secuencia de aminoácidos según ID Sec. Nº: 8.

8. Procedimiento para la producción de un ácido carboxílico a partir de nitrilos mediante la puesta en contacto de 20 un nitrilo con una nitrilasa según una de las reivindicaciones anteriores.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 para la producción de un ácido carboxílico seleccionado entre el grupo consistente en ácido 4-cianopentanoico, ácido 3-hidroxivalérico y ácido glicólico.