Internalización fotoquímica para el suministro de moléculas mediado por virus en el citosol.

Un método in vitro o ex vivo para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula,

comprendiendo dichométodo poner en contacto dicha célula con un agente fotosensibilizador, poner en contacto dicha célula con lamolécula que se va a introducir (molécula de transferencia) que está incorporada en o conectada con un vehículovírico, e irradiar dicha célula con luz a una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en dondedicho vehículo vírico es un adenovirus o un virus adenoasociado y dicho agente fotosensibilizador se ubica enendosomas, lisosomas, el retículo endoplásmido o el aparato de Golgi.

Internalización fotoquímica para el suministro de moléculas mediado por virus en el citosol

Método La presente invención se refiere a un método de introducción de moléculas en células usando un agente fotosensibilizador e irradiación de células con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en donde la molécula que se va a introducir está asociada con un vehículo vírico y en particular un vehículo adenovírico. La presente invención se refiere además al uso de este método en la terapia génica.

Se reconoce que la terapia génica, es decir la modificación genética de las células de un paciente con el fin de combatir una enfermedad, tiene un gran potencial terapéutico para tratar una variedad de enfermedades, tales como el cáncer, enfermedades infecciosas incluyendo infecciones víricas y bacterianas, enfermedades cardiovasculares, trastornos hereditarios tales como fibrosis quística, trastornos del sistema inmunitario y otras muchas afecciones. Sin embargo, el desarrollo clínico de la terapia génica todavía se enfrenta a muchos desafíos no resueltos, de los cuales uno de los más importantes es encontrar métodos para el suministro eficaz y específico de genes terapéuticos a las células diana in vivo (Verma & Somia, 1997, Nature, vol. 389, 239-242 y Anderson, 1998, Nature vol. 392, 25-30) .

La terapia génica puede implicar muchos posibles procedimientos diferentes y puede implicar la transferencia de genes o segmentos de genes humanos clonados, genes o segmentos de genes humanos de doble cadena, genes de otros genomas y organismos, oligonucleótidos y diferentes genes artificiales o fragmentos de los mismos tales como genes de sentido contrario.

En los métodos actuales se han sugerido muchos vehículos o vectores diferentes para usar para lograr la transferencia en la terapia génica. Como ejemplos, se pueden mencionar compuestos policatiónicos, lípidos catiónicos y sistemas víricos, pero hasta ahora la terapia génica in vivo ha tenido poco éxito. Entre los muchos inconvenientes conocidos de los métodos actuales están la baja estabilidad en el suero del vector, especificidad limitada en el suministro génico, baja eficacia en el suministro génico etc. El uso de vehículos víricos se ha hecho con precaución particular debido a la introducción de elementos víricos en hospedantes que pueden causar efectos adversos tales como inflamación, que no están compensados por la transferencia potenciada comparada con otros métodos.

La mayoría de las moléculas no penetran fácilmente las membranas celulares. Los métodos para introducir moléculas en el citosol de células vivas son conocidos en la técnica y son herramientas útiles para manipular y estudiar procesos biológicos. Entre los métodos usados más habitualmente están la microinyección, fusión mediada por fantasmas de eritrocitos y fusión de liposomas, lisis osmática de pinosomas, raspado de la membrana celular, electroporación, fosfato de calcio y transfección mediada por virus. Estas técnicas son útiles para manipular células en cultivo, aunque en muchos casos pueden ser impracticables, requerir mucho tiempo, ineficaces o pueden inducir muerte celular significativa. Por lo tanto, dichas técnicas no son óptimas para usar en investigación biológica o médica, o en terapias, donde a menudo no son suficientemente eficaces, pueden tener efectos tóxicos intolerables o pueden no se aplicables por razones técnicas.

Es bien conocido que las porfirinas y muchos otros compuestos fotosensibilizadores pueden inducir efectos citotóxicos en células y tejidos. Estos efectos se basan en el hecho de que tras exposición a la luz, el compuesto fotosensibilizador puede convertirse en tóxico o puede liberar sustancias tóxicas tales como oxígeno singlete u otras especies oxidantes que dañan el material celular o biomoléculas, incluyendo las membranas celulares y estructuras celulares, y dicho daño celular o de membrana finalmente puede matar a las células. Estos efectos se han usado en el tratamiento de diferentes anomalías o trastornos, incluyendo en especial enfermedades neoplásicas. El tratamiento se llama terapia fotodinámica (PDT) e implica la administración de agentes fotosensibilizadores (fotoquimioterapéuticos) a la zona afectada del cuerpo, seguido de la exposición a luz fotoactivante con el fin de activar agentes fotosensibilizadores y convertirlos en la forma citotóxica, de modo que las células afectadas mueren

o disminuye su potencial proliferativo. Se conocen agentes fotosensibilizadores que localizarán de forma preferencial

o selectiva el sitio diana deseado, p. ej., en un tumor u otra lesión.

Se conocen una variedad de agentes fotosensibilizadores, incluyendo en particular psoralenos, porfirinas, clorinas y ftalocianinas. Dichos fármacos se vuelven tóxicos cuando se exponen a la luz.

Los fotosensibilizadores porfirínicos actúan indirectamente por generación de especies de oxígeno tóxicas, y se consideran candidatos particularmente favorables para PDT. Las porfirinas son precursores naturales en la síntesis del grupo hemo. En particular, el grupo hemo se produce cuando se incorpora hierro (Fe3+) en la protoporfirina IX (PpIX) por acción de la enzima ferroquelatasa. La PpIX es un fotosensibilizador muy potente, mientras que el grupo hemo no tiene efecto fotosensibilizador. Se conocen una variedad de fotosensibilizadores basados en porfirina o relacionados con porfirina en la técnica y están descritos en la bibliografía.

El efecto citotóxico es mediado principalmente por la formación de oxígeno singlete. Este producto intermedio reactivo tiene un tiempo de vida muy corto en las células (<0, 04 μs) . Por lo tanto, el efecto citotóxico principal de PDT se produce durante la exposición a la luz y muy cerca de los sitios de formación de 1O2. El 1O2 reacciona y oxida proteínas (histidina, triptófano, metionina, cisteína, tirosina) , ADN (guanina) , ácidos grasos insaturados y colesterol. Una ventaja de la PDT es que los tejidos no expuestos a la luz se pueden dejar sin afectar, es decir, que se puede obtener un efecto de PDT selectivo. Hay una amplia documentación en relación con el uso de la PDT para destruir poblaciones celulares no deseadas, por ejemplo células neoplásicas. La bibliografía de patentes describe una serie de compuestos fotodinámicos, solos o conjugados con agentes directores, p. ej., inmunoglobulinas dirigidas a determinados receptores de células neoplásicas, que hacen al complejo más específicos de la célula. Algunos compuestos fotoquímicos, tales como los derivados de hematoporfirina, tienen además una capacidad inherente para localizar células malignas. Dichos métodos y compuestos se describen en la patente noruega nº 173319 y en las solicitudes de patente noruegas nº 900731, 176645, 176947, 180742, 176786, 301981, 300499 y 891491. Dichos métodos de PDT dependen, por lo tanto, de la destrucción de estructuras celulares que conducen a la muerte celular.

Por otra parte, el documento WO 96/07432 o la solicitud de patente en tramitación junto con la presente WO 00/54802, se refieren a métodos que usan el efecto fotodinámico como mecanismo para introducir moléculas de otra forma impermeables a través de la membrana al citosol de una célula de una forma que no produce necesariamente la destrucción celular extendida o muerte celular. En estos métodos, se aplican la molécula que se va a internalizar y un compuesto fotosensibilizador de forma simultánea o secuencial a las células, después de lo cual el compuesto fotosensibilizador y la molécula son endocitados o translocados de otra forma dentro de los endosomas, liposomas u otros compartimentos intracelulares restringidos con membrana.

La molécula que se va a translocar y el compuesto fotosensibilizador se aplican a las células juntos o de forma secuencial (preferiblemente por separado y de forma secuencial) y son absorbidos por la célula juntos en los mismos compartimentos intracelulares (es decir, son cotranslocados) . La molécula que se va a internalizar dentro de la célula después es liberada por exposición de las células a la luz de longitudes de onda adecuadas para activar el compuesto fotosensibilizador, que a su vez conduce a la alteración de las membranas de los compartimentos celulares y la posterior liberación de la molécula, que se encuentra en el mismo compartimento que el agente fotosensibilizador, en el citosol. Este método se denominó “internalización fotoquímica” o PCI. Por lo tanto, en estos métodos, la etapa final de exposición de las células a la luz da como resultado que la molécula en cuestión sea liberada del mismo compartimento intracelular que el agente fotosensibilizador... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro o ex vivo para introducir una molécula de ácido nucleico en una célula, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un agente fotosensibilizador, poner en contacto dicha célula con la molécula que se va a introducir (molécula de transferencia) que está incorporada en o conectada con un vehículo vírico, e irradiar dicha célula con luz a una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en donde dicho vehículo vírico es un adenovirus o un virus adenoasociado y dicho agente fotosensibilizador se ubica en endosomas, lisosomas, el retículo endoplásmido o el aparato de Golgi.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde dicha célula es de mamífero.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha molécula de transferencia es una molécula de ácido nucleico que comprende un gen de longitud completa o ADNc u otro ADN que lo codifica, o un fragmento funcional de los mismos.

4. Un método según la reivindicación 3, en donde dicha molécula de ácido nucleico codifica una enzima activadora de profármaco, una toxina proteica, una proteína inductora de apoptosis, un factor inmunoestimulador, un antígeno específico de tumor, un inhibidor inmunitario/inflamatorio, un inhibidor de angiogénesis, una proteína que induce la formación de vasos, una proteína de inicio de la coagulación, un anticuerpo intracelular o una inmunotoxina recombinante.

5. Un método según la reivindicación 1 ó 2, en donde dicha molécula de transferencia es una molécula de ácido nucleico que codifica una molécula de ARN de sentido contrario, un ribozima, un aptámero, un oligonucleótido o un oligonucleótido que forma triple hélice.

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde dicha molécula de ácido nucleico tienen de 20 a 10.000 bases de longitud.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la molécula de transferencia es un polinucléotido y se inserta en una construcción vírica que contiene elementos derivados de virus necesarios para permitir que la construcción quede empaquetada dentro del vehículo vírico.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho vehículo vírico es un adenovirus.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde el agente fotosensibilizador está separado del vehículo vírico.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde el agente fotosensibilizador y el vehículo vírico se ponen en contacto con dicha célula de forma secuencial.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el agente fotosensibilizador se selecciona del grupo que consiste en TPPS2a, AlPcS2a y otros fotosensibilizadores anfifílicos.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde dichos agentes fotosensibilizadores son compuestos que son el ácido 5-aminolevulínico o ésteres de ácidos 5-aminolevulínicos o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde dicho agente fotosensibilizador se pone en contacto con dichas células durante 4 a 24 h antes de irradiación.

14. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde uno de o tanto el agente fotosensibilizador como el vehículo vírico están unidos a, asociados con o conjugados con una o mas moléculas vehículo, moléculas o vectores directores.

15. Un método según la reivindicación 14, en donde dicho vehículo vírico está unido a, asociado con o conjugado con una molécula vehículo.

16. Un método según la reivindicación 14 ó 15, en donde dicha molécula vehículo comprende un policatión o lípido catiónico.

17. Un método según la reivindicación 16, en donde dicho policatión es poli-L-lisina, poli-D-lisina o SuperFect®.

18. Un método según la reivindicación 16, en donde dicho lípido catiónico es DOTAP.

19. Un método según las reivindicaciones 15 ó 16, en donde dicha molécula vehículo es un liposoma o construcción basada en lípido, que contiene preferiblemente al menos un lípido catiónico.

20. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde al menos 50% de dichas células en las que se introduce dicha molécula no son destruidas.

21. Una composición farmacéutica que comprende una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador, en donde dicha molécula de transferencia, vehículo vírico y agente fotosensibilizador se definen como en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

22. Una composición según la reivindicación 21, para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o infección, en donde dicha molécula de transferencia es una molécula terapéutica.

23. Una composición según la reivindicación 22, para usar en terapia génica.

24. Uso de una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador para preparar un medicamento para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o infección, en donde dicho vehículo vírico es un adenovirus o virus adenoasociado y dicho agente fotosensibilizador se ubica en endosomas, lisosomas, el retículo endoplasmático o el aparato de Golgi, en donde dicha molécula de transferencia es una molécula terapéutica y en donde dicha molécula de transferencia o dicho vehículo vírico o dicho agente fotosensibilizador es una molécula de transferencia o un vehículo vírico o un agente fotosensibilizador como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 12 ó 14 a 19.

25. El uso según la reivindicación 24, para usar en terapia génica.

26. Un uso según la reivindicación 25 o una composición según la reivindicación 23, donde dicha terapia génica se logra mediante la destrucción dirigida de células específicas, inhibición dirigida de expresión génica, terapia de aumento o corrección de mutación por la introducción de un gen o una parte del mismo, capaz de expresar un producto funcional para compensar una deficiencia en un paciente, en donde hay que administrar in vivo preferiblemente de 103 a 1015 partículas víricas.

27. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26 o una composición según la reivindicación 22 ó 23, en donde dicha enfermedad, trastorno o infección es cáncer, artritis reumatoide, arterosclerosis, infecciones víricas u otras, psoriasis, queratosis solar, una herida, una fractura, una verruga o un trastorno genético hereditario.

28. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27, en donde dicha molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y dicho agente fotosensibilizador son para la administración separada.

29. Una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador para usar en el tratamiento o prevención de una enfermedad, trastorno o infección, en donde dicho vehículo vírico es un adenovirus o virus adenoasociado y dicho agente fotosensibilizador se encuentra en endosomas, lisosomas, el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi, en donde dicha molécula de transferencia es una molécula terapéutica y en donde dicha molécula de transferencia o dicho vehículo vírico o dicho agente fotosensibilizador es una molécula de transferencia o un vehículo vírico o un agente fotosensibilizador como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 12 ó 14 a 19.

30. Una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador según la reivindicación 29, para usar en terapia génica.

31. Una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador según la reivindicación 29 ó 30, en donde dicha molécula de transferencia y agente fotosensibilizador son para usar juntos o por separado.

32. Una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador según la reivindicación 30, en donde dicha terapia génica se logra mediante la destrucción dirigida de células específicas, inhibición dirigida de expresión génica, terapia de aumento o corrección de mutación por la introducción de un gen o una parte del mismo, capaz de expresar un producto funcional para compensar una deficiencia en un paciente, en donde hay que administrar in vivo preferiblemente de 103 a 1015 partículas víricas.

33. Una molécula de transferencia incorporada en o conectada con un vehículo vírico y un agente fotosensibilizador según la reivindicación 29 o reivindicación 30, en donde dicha enfermedad, trastorno o infección es cáncer, artritis reumatoide, arterosclerosis, una infección vírica u otras, psoriasis, queratosis solar, una herida, una fractura, una verruga o un trastorno genético hereditario.

Figura 1 Figura 2A Figura 2B Figura 3A

Figura 3B Figura 4 Figura 5

Figura 6 Figura 7

Figura 8 Figura 9

Figura 10 Figura 11

Figura 12 Figura 13 Figura 14