Un método in vitro o ex vivo para introducir una molécula en el citosol de una célula,

método que comprende poner dicha célula en contacto con un agente fotosensibilizador que se localiza en endosomas, lisosomas, el retículo endoplásmico o el aparato de Golgi, poner dicha célula en contacto con la molécula que se va a introducir (molécula de transferencia) e irradiar dicha célula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en que dicha irradiación se lleva a cabo en un tiempo antes o al mismo tiempo que la puesta en contacto de dicha célula con la molécula de transferencia, en que (i) la molécula de transferencia no penetra fácilmente en las membranas celulares, y/o (ii) uno del agente fotosensibilizador y la molécula de transferencia, o ambos, están fijados a, asociados con, o conjugados con, una o más moléculas vehiculares, moléculas para transporte dirigido o vectores.

Internalización fotoquimica para suministrar moleculas en el citosol Metodoº

El presente invento se refiere a un metodo mejorado para introducir moleculas en el citosol de celulas usando un agente fotosensibilizador e irradiación de las celulas con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador.

La mayoria de las moleculas no penetra facilmente en las membranas celulares. Los metodos para introducir moleculas en el citosol de celulas vivas son herramientas utiles para manipular y estudiar procesos biológicos. Entre los metodos mas comunmente usados hoy en dia estan la microinyección, la fusión mediada por fantasmas de gl6bulos rojos y la fusión de liposomas, la lisis osmótica de pinosomas, la carga por raspado, la electroporación, el fosfato calcico y la transfección mediada por virus. Estas tecnicas son utiles para investigar celulas en cultivo aunque, en muchos casos, pueden ser poco practicas, ineficaces o consumir mucho tiempo, o pueden provocar una muerte celular significativa. Por lo tanto, dichas tecnicas no son óptimas para uso en investigación biológica ni medica ni en terapias en que se requiere que las celulas permanezcan viables y/o funcionales.

Es bien sabido que las porfirinas y muchos otros compuestos fotosensibilizadores pueden provocar efectos citot6xicos en celulas y tejidos. Estos efectos se basan en el hecho de que, tras la exposición a luz, el compuesto fotosensibilizador se puede volver t6xico o puede liberar sustancias t6xicas, tales como oxigeno singlete u otros radicales oxidantes, que son perjudiciales para el material celular o las biomoleculas, incluyendo las membranas de celulas y estructuras celulares, y dicho dano celular o membranal puede matar finalmente a las celulas. Estos efectos han sido utilizados en el tratamiento de diversas anormalidades o trastornos, incluyendo especialmente las enfermedades neoplasicas. El tratamiento es denominado "terapia fotodinamica" (PDT; del ingles, photodynamic therapy) e implica la administración de agentes fotosensibilizadores (fotoquimioterapeuticos) a la zona afectada del cuerpo, seguida de la exposición a luz activadora con objeto de activar los agentes fotosensibilizadores y convertirlos en una forma citot6xica, por lo que las celulas afectadas son matadas o su potencial proliferativo resulta disminuido. Se conocen agentes fotosensibilizadores que se localizan preferente o selectivamente en el sitio diana deseado, tal como, por ejemplo, un tumor u otra lesión.

Se conoce una diversidad de agentes fotosensibilizadores, incluyendo notablemente los psoralenos, las porfirinas, las clorinas y las ftalocianinas. Dichos farmacos se vuelven t6xicos cuando son expuestos a luz.

Los farmacos fotosensibilizadores pueden ejercer sus efectos mediante una diversidad de mecanismos, directa o indirectamente. De este modo, por ejemplo, ciertos fotosensibilizadores se vuelven directamente t6xicos cuando son activados por luz, mientras que otros actuan para generar especies t6xicas, tales como, por ejemplo, agentes oxidantes tales como oxigeno singlete y otros radicales libres derivados del oxigeno, que son sumamente destructivos para el material celular y para biomoleculas tales como lipidos, proteinas y acidos nucleicos.

Los fotosensibilizadores de porfirina actuan indirectamente por generación de especies oxigenadas t6xicas y son considerados como candidatos particularmente favorables para la PDT. Las porfirinas son precursores de la sintesis de hemo presentes en la naturaleza. En particular, se produce hemo cuando se incorpora hierro (Fe3+) a la protoporfirina IX (PpIX) por la acción de la enzima ferroquelatasa. PpIX es un fotosensibilizador muy potente, mientras que el hemo no ejerce efecto fotosensibilizador alguno. Se conoce en la tecnica y se describe en la bibliografia una diversidad de fotosensibilizadores basados en porfirina o relacionados con la porfirina.

El efecto citot6xico de la mayoria de los sensibilizadores usados en la PDT es mediado principalmente a traves de la formación de oxigeno singlete, formado tras la exposición de los fotosensibilizadores a la luz. Este intermedio reactivo tiene un tiempo de vida muy corto en las celulas ( 0, 04 Is) . Por lo tanto, el efecto citot6xico primario de la PDT se ejecuta durante la exposición luminica y muy próximo a los sitios de formación de 102. El 102 reacciona con proteinas (histidina, tript6fano, metionina, cisteina, tirosina) , DNA (guanina) , acidos grasos insaturados y colesterol y los oxida. Una de las ventajas de la PDT es que los tejidos no expuestos a la luz pueden quedar inafectados; es decir, que se puede obtener un efecto de PDT selectivo. Hay una amplia documentación relativa al uso de PDT para destruir poblaciones celulares indeseadas, tales como, por ejemplo, celulas neoplasicas. En la bibliografia de patentes se describen diversos compuestos fotodinamicos, solos o conjugados con agentes para transporte dirigido, tales como, por ejemplo, inmunoglobulinas dirigidas a determinantes de receptores de celulas neoplasicas, lo que hace que el complejo sea mas celularmente especifico. Ciertos compuestos fotoquimicos, tales como derivados de hematoporfirina, tienen ademas la capacidad inherente de localizarse en celulas malignas. Dichos metodos y compuestos se describen en la patente noruega nO 173319 y en las solicitudes de patente noruega numeros 900731, 176645, 176947, 180742, 176786, 301981, 300499 y 891491.

En el Documento W0 93/14142 se describe un sistema para distribución de farmacos que comprende un agente anticanceroso y un agente fotoactivable (es decir, un fotosensibilizador) fijados a vehiculos copolimeros. Tras la administración, este complejo entra en el interior de la celula por pinocitosis o fagocitosis y se localiza dentro de los endosomas y lisosomas. En los lisosomas, se hidroliza el enlace entre el agente antineoplasico y el polimero y el

primero puede difundirse pasivamente en el citosol a traves de la membrana lisos6mica. La utilidad de este metodo esta por ello limitada a pequenos compuestos moleculares que son capaces de difundirse a traves de las membranas lisos6micas. Despues de dejar un periodo de tiempo para la difusión, se aplica una fuente luminica de longitud de onda y energia apropiadas para activar el compuesto fotoactivable. El efecto combinado del agente anticanceroso y el agente fotoactivable destruye la celula. Dichos metodos de PDT como los anteriormente descritos se dirigen por tanto a una destrucción de estructuras celulares que conduzca a la muerte celular.

Por otro lado, los Documentos W0 96/07432 y W0 00/54802 son relativos a metodos en que se usa el efecto fotodinamico como un mecanismo para introducir moleculas, para las que de otro modo la membrana resulta impermeable, en el citosol de una celula de una manera que no de necesariamente lugar a una destrucción celular ni una muerte celular generalizadas. En este metodo, se aplican simultanea o sucesivamente la molecula que se va a internalizar y un compuesto fotosensibilizador a las celulas, tras lo cual el compuesto fotosensibilizador y la molecula son endocitados o, en otros casos, translocados a endosomas, lisosomas u otros compartimentos restringidos por membrana intracelular.

La molecula que se va a translocar a compartimentos intracelulares de las celulas y el compuesto fotosensibilizador son conjunta o sucesivamente aplicados a las celulas y son conjuntamente incorporados por las celulas a los mismos compartimentos intracelulares (es decir, son cotranslocados) . La molecula que se va a internalizar en la celula es luego liberada por exposición de las celulas a luz de longitud de onda adecuada para activar el compuesto fotosensibilizador, lo que conduce a su vez a la rotura de las membranas de los compartimentos intracelulares y a la subsiguiente liberación de la molecula, que esta localizada en el mismo compartimento que el agente fotosensibilizador, en el citosol. Este metodo fue denominado "internalización fotoquimica" o PCI (del ingles, photochemical internalisation) . De este modo, en estos metodos, la operación final de exponer las celulas a luz da lugar a que la molecula en cuestión sea liberada del mismo compartimiento intracelular que el del agente fotosensibilizador y llegue aestar presente en el citosol.

Se creia que, con objeto de que este metodo fuera eficaz, era esencial que tanto el compuesto fotosensibilizador como la molecula que iba a ser liberada en el citosol estuvieran presentes en los mismos compartimentos intracelulares cuando se llevara a cabo la irradiación.

Se ha hallado ahora sorprendentemente que se pueden introducir moleculas... [Seguir leyendo]

1. Un metodo in vitro o ex vivo para introducir una molecula en el citosol de una celula, metodo que comprende poner dicha celula en contacto con un agente fotosensibilizador que se localiza en endosomas, lisosomas, el reticulo endoplasmico o el aparato de Golgi, poner dicha celula en contacto con la molecula que se va a introducir (molecula de transferencia) e irradiar dicha celula con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, en que dicha irradiación se lleva a cabo en un tiempo antes o al mismo tiempo que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que (i) la molecula de transferencia no penetra facilmente en las membranas celulares, y/o (ii) uno del agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia, o ambos, estan fijados a, asociados con, o conjugados con, una o mas moleculas vehiculares, moleculas para transporte dirigido o vectores.

2. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 1, en que la celula es puesta en contacto con la molecula de transferencia en un punto temporal despues de que haya tenido lugar la irradiación.

3. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 2, en que la celula es puesta en contacto con dicha molecula de transferencia de 0 a 4 horas despues de que haya tenido lugar la irradiación.

4. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 1, en que la celula es puesta en contacto con la molecula de transferencia en el mismo momento que la irradiación.

5. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en que la molecula de transferencia es puesta en contacto con dicha celula durante un periodo de 30 minutos a 6 horas.

6. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha molecula de transferencia es una proteina, peptido, anticuerpo o antigeno o fragmento del mismo.

7. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 6, en que dicha molecula de transferencia, o una parte o fragmento de la misma, se presenta o expresa en la superficie celular.

8. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 8, en que dicha celula es una celula presentadora de antigeno.

9. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha molecula de transferencia es un farmaco citot6xico.

10. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, en que dicha molecula de transferencia es una molecula de acido nucleico.

11. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 10, en que dicha molecula de acido nucleico esta incorporada a una molecula vector.

12. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en que el agente fotosensibilizador es seleccionado del grupo que consiste en TPPS4, TPPS2a, AlPcS2a y otros fotosensibilizadores anfipaticos.

13. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en que dichos agentes fotosensibilizadores son compuestos que son el acido 5aminolevulinico o esteres del acido 5aminolevulinico o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos.

14. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 13, en que dicho agente fotosensibilizador es puesto en contacto con dichas celulas durante un periodo de 4 a 24 horas antes de la irradiación.

15. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 14, en que dicho agente fotosensibilizador es puesto en contacto con dichas celulas durante un periodo de 4 a 24 horas inmediatamente antes de la irradiación.

16. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 15, en que dicho agente fotosensibilizador es retirado despues del contacto con dicha celula durante un periodo de 1 a 4 horas antes de la irradiación.

17. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 16, en que el vehiculo, la molecula para transporte dirigido o el vector al que, o con el que, se fija, asocia o conjuga la molecula de transferencia es un adenovirus, un policatión, un lipido catiónico o un peptido o un vector dirigido.

18. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 17, en que dicha molecula de transferencia se fija a, o se asocia o conjuga con, un vector, y dicho vector se fija a, o se asocia o conjuga con, una molecula vehicular, una molecula para transporte dirigido o un vector.

19. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las 1. a 18, en que dicho vector es un adenovirus.

20. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 17, en que dicho policatión es poliLlisina, poliDlisina o SuperFect@.

21. Un metodo como el reivindicado en la Reivindicación 17 o 18, en que dicho lipido catiónico es D0TAP.

22. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 19, en que dicha molecula vehicular es un liposoma o una construcción de base lipidica, que contiene preferiblemente al menos un lipido catiónico.

23. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8 o 10 a 22, en que al menos el 50% de dichas celulas en que se introduce dicha molecula no resultan muertas.

24. Un metodo como el reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 23, en que la operación de irradiación es de 1 a 10 minutos.

25. Uso de una molecula de transferencia y un agente fotosensibilizador, en que el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia son como se definen en cualquier reivindicación precedente, para la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o infección, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiación se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

26. Uso de una molecula de transferencia como se define en cualquier reivindicación precedente, para la preparación de un medicamento para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o infección, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicha enfermedad, trastorno o infección se va a tratar poniendo celulas o tejidos de un paciente en contacto con dicho medicamento, y, separadamente, un agente fotosensibilizador como el definido en cualquier reivindicación precedente se va a poner en contacto con dichas celulas o tejidos de dicho paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiación se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

27. Una composición que contiene una molecula de transferencia y, separadamente, un agente fotosensibilizador, en que el agente fotosensibilizador y la molecula de transferencia son como se definen en cualquier reivindicación precedente, como una composición combinada para uso separado o secuencial en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o infección, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar

o prevenir un cancer, en que dicho agente fotosensibilizador y, separadamente, dicha molecula de transferencia se van a poner en contacto con celulas o tejidos de un paciente y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiación se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

28. Una molecula de transferencia como la definida en cualquier reivindicación precedente, para uso en el tratamiento o la prevención de una enfermedad, trastorno o infección, preferiblemente para terapia genica, estimular una respuesta inmune o tratar o prevenir un cancer, en que dicha enfermedad, trastorno o infección se va a tratar poniendo celulas o tejidos de un paciente en contacto con dicha molecula de transferencia, y, separadamente, un agente fotosensibilizador como el definido en cualquier reivindicación precedente se va a poner en contacto con dichas celulas o tejidos de dicho paciente, y dichas celulas se van a irradiar con luz de una longitud de onda eficaz para activar el agente fotosensibilizador, y la irradiación se va a llevar a cabo en un momento antes o en el mismo momento que la puesta en contacto de dicha celula con la molecula de transferencia, en que dicha molecula de transferencia es una molecula terapeutica.

29. Un uso, composición o molecula de transferencia como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 25 a 28, en que dicho metodo de incorporación celular se va a llevar a cabo del modo descrito en cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 5, 14, 15, 16, 23 o 24.

30. Un uso, composición o molecula de transferencia como se reivindica en cualquiera de las Reivindicaciones 25 a 29 para vacunación, en que dicha molecula de transferencia es una molecula antigenica y dicha molecula de transferencia, o una parte o fragmento de la misma, se va a presentar o expresar en la superficie celular.

Figura1

Figura2

Figura3

Figuraº

Figuraº

Figura7

Figura8

Figuraº11