Constructos multivalentes para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

Compuesto multivalente que comprende dos polipéptidos que tienen especificidad por epítopos diferentes en un receptor proteína-tirosina cinasa seleccionado del grupo que consiste en KDR y cMet,

en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en **Fórmula**

Constructos multivalentes para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico

Campo de la invención La invención se refiere a composiciones y métodos para aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico.

Antecedentes de la invención Los investigadores han intentado desde hace mucho tiempo explotar la capacidad de ligandos o restos de direccionamiento para unirse a células específicas (por medio de receptores o de otra forma) para dirigir composiciones tales como marcadores detectables o agentes terapéuticos a tejidos particulares de un animal (especialmente un ser humano) . En tales situaciones, la capacidad del resto de direccionamiento para unirse a la diana (por ejemplo, afinidad, avidez y/o especificidad) tiene un impacto significativo sobre la capacidad para seleccionar como diana satisfactoriamente los tejidos deseados.

Se han hecho numerosos intentos para usar anticuerpos naturales (por ejemplo policlonales) y monoclonales como restos de direccionamiento in vivo. Sin embargo, el uso de tales anticuerpos presenta determinadas desventajas, tales como niveles inaceptables de antigenicidad, incluso para anticuerpos humanizados. Además, los anticuerpos naturales son difíciles de producir en forma recombinante, debido al número de cadenas, enlaces disulfuro y glicosilación. Los anticuerpos naturales también presentan problemas farmacocinéticos. Los anticuerpos plantean problemas significativos en aplicaciones de obtención de imágenes y radioterápicas porque, debido a su gran tamaño, la acumulación en tejido diana extravascular y el aclaramiento del sistema vascular son ambos lentos. Este problema es especialmente crítico cuando se trata con tumores sólidos, que presentan barreras adicionales al ingreso de compuestos grandes transportados por la sangre. Se producen problemas similares con anticuerpos usados para obtener imágenes usando otras modalidades, tales como obtención de imágenes por resonancia magnética (MRI) , ultrasonidos y luz visible. Si el anticuerpo está radiomarcado con un radionúclido terapéutico o de diagnóstico, razones inferiores de diana con respecto a fondo dan como resultado las imágenes. Además, se produce una distribución no deseable de la exposición a la radiación entre tejidos tumorales y normales.

En intentos por solucionar estos problemas, los esfuerzos se han dirigido hacia la construcción de entidades más pequeñas con afinidades de unión similares usando las características esenciales de las regiones de unión de anticuerpos naturales. Los bloques de construcción son normalmente fragmentos Fv de cadena sencilla (scFv) que 35 son monovalentes. La combinación de fragmentos de este tipo para que tengan las propiedades bivalentes o multivalentes de los anticuerpos ha sido problemática. Con el fin de acoplarse a una superficie es una ventaja que los dos sitios de unión en el anticuerpo estén conectados por medio de una bisagra flexible a la región constante. Por tanto, con el fin de imitar la eficacia de unión de los anticuerpos, no sólo debe recrearse el sitio de unión, sino que también la bivalencia (o valencia superior) y la flexibilidad. Esta flexibilidad es necesaria porque la estructura principal de la proteína que constituye la región de no unión del scFv es todavía voluminosa en relación con el sitio de unión. Una vez que se ha ideado un método apropiado para unir dos fragmentos scFv juntos, pueden unirse diferentes fragmentos scFv juntos así como más de los dos restos de scFv habituales presentes en anticuerpos naturales. Determinados fragmentos scFv, dependiendo tanto de la superficie de contacto VH/VL como de la longitud del ligador, pueden dimerizarse o multimerizarse espontáneamente. Estos “diacuerpos” son más pequeños 45 que el anticuerpo natural y no tienen las propiedades inmunológicas de la parte Fc (que activa el complemento y/o se une a receptores de Fc) , de la que carecen. Los dos (o más) sitios de unión están rotados en relación uno con respecto a otro, y por tanto el antígeno debe colocarse correctamente para adaptarse a esta presentación.

Los “minianticuerpos” tienen propiedades similares a las de diacuerpos, pero en vez de un ligador de 5-20 aminoácidos corto tienen un ligador relativamente más flexible que permite una orientación más libre de los sitios de unión unos con respecto a otros, similar a un anticuerpo natural. Como los diacuerpos, los minianticuerpos no tienen el fragmento de dímero de Fc inmunológicamente activo, de alto peso molecular. También pueden producirse mediante sistemas bacterianos. Aunque tienen ventajas deseadas con respecto a anticuerpos naturales, los minianticuerpos todavía tienen un tamaño relativamente grande, que afecta a su farmacocinética, y deben 55 producirse usando métodos biológicos. El minianticuerpo más pequeño tiene aproximadamente 120 kDa de tamaño.

Se han hecho intentos de usar anticuerpos biespecíficos (por ejemplo anticuerpos que se unen a dos dianas separadas) para superar una de las principales deficiencias de los anticuerpos, concretamente, que el tamaño de los anticuerpos ralentiza su acumulación en el tejido diana extravascular y su aclaramiento de la sangre. El enfoque biespecífico adoptado se ha denominado “predireccionamiento”. Este enfoque usa un protocolo de dos etapas. Un anticuerpo biespecífico con al menos un brazo que reconoce un antígeno asociado a tumor y al menos otro brazo que reconoce un epítopo en un agente de diagnóstico o terapia se administra como primera inyección. Tras haberse aclarado sustancialmente el anticuerpo no unido de tejidos no diana y haber alcanzado un nivel máximo en el tumor, se administra el agente terapéutico o de diagnóstico reconocible por el anticuerpo biespecífico, más pequeño. Se 65 espera que este último agente se distribuya más rápidamente por todo el cuerpo, y o bien se une al anticuerpo biespecífico localizado en el tumor, o bien se aclara por medio de los riñones.

Una alternativa a este enfoque intenta usar un sistema de avidina/biotina de anticuerpo mixto en un procedimiento de dos etapas. Por ejemplo, se conjuga un anticuerpo de direccionamiento con o bien avidina o bien biotina y entonces se inyecta tras lo cual se localiza en el tumor de interés. Después de eso, se inyecta o bien biotina o bien avidina (dependiendo de lo que se acopló al anticuerpo de direccionamiento) , que porta un radionúclido radioterápico o de obtención de imágenes, y se localiza en el sitio del anticuerpo primario mediante unión a avidina o biotina respectivamente.

Otro enfoque para el uso de anticuerpos como restos de direccionamiento para agentes radiofarmacéuticos u otros agentes de obtención de imágenes de diagnóstico ha intentado usar un hapteno bivalente para aumentar la avidez por el anticuerpo biespecífico unido a la célula con respecto a la del anticuerpo circulante. Este enfoque se basa en la unión bidentada que se produce con los anticuerpos unidos a células, porque la densidad de superficie en las células es lo suficientemente alta, pero no ocurre lo mismo con los anticuerpos circulantes, porque la concentración es demasiado baja. En efecto, el sistema hace uso del aumento en la avidez provocado por la presentación más estrecha de los anticuerpos/antígeno sobre las células.

También se han usado péptidos como restos de direccionamiento. En un intento por mejorar la unión, se han preparado constructos de péptidos biespecíficos con dos o más agentes de direccionamiento a base de péptidos selectivos para diferentes dianas. Por ejemplo, se preparó de manera notificada un péptido híbrido que tiene ligandos para dos dianas seleccionadas del receptor de somatostatina, GRP, CCK, sustancia P o VIP e integrina αvβ3 y se sometió a prueba para determinar la capacidad para unirse a células tumorales. La evaluación inicial no mostró captación tumoral mejorada para los sistemas de múltiples ligandos investigados. Los investigadores supusieron que las alteraciones estéricas conducen a una reducción de las afinidades por el receptor de las estructuras diméricas. Otros han sometido a prueba un péptido híbrido de RGD-DTPA-octreotato dirigido hacia tanto la integrina αvβ3 como el receptor de somatostatina-2 para determinar la capacidad para aumentar la captación tumoral con respecto a la de un péptido selectivo para una de las otras dianas. Las afinidades de unión diferentes de los dos restos de direccionamiento hacia sus dianas, vasos sanguíneos y células tumorales, respectivamente, dio como resultado que la avidez por los tumores estuviese dominada por la interacción más fuerte (mediada por somatostatina) .

Una variación de estos enfoques usa un diacuerpo biespecífico dirigido a dos epítopos diferentes en el mismo antígeno.... [Seguir leyendo]

1. Compuesto multivalente que comprende dos polipéptidos que tienen especificidad por epítopos diferentes en un receptor proteína-tirosina cinasa seleccionado del grupo que consiste en KDR y cMet, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que los polipéptidos tienen especificidad por epítopos diferentes en KDR y el compuesto se selecciona del grupo que consiste en D1, D5, D6, D7, D9, D17, D19, D20, D22, D23, D24, D25, D26, D27, D31.

3. Compuesto según la reivindicación 1, que comprende además al menos un grupo de marcaje, comprendiendo preferiblemente el grupo de marcaje

un grupo detectable mediante obtención de imágenes por resonancia magnética, obtención de imágenes por ultrasonidos, obtención de imágenes óptica, obtención de imágenes por sonoluminiscencia, obtención de imágenes por fotoacústica u obtención imágenes nuclear, o un agente de contraste por ultrasonidos, un fotomarcador o una molécula bioluminiscente o un agente terapéutico, comprendiendo preferiblemente el agente terapéutico un agente bioactivo, un agente citotóxico, un fármaco, un agente quimioterápico o un agente radioterápico.

4. Compuesto según la reivindicación 3, en el que el grupo de marcaje o agente terapéutico comprende uno o más quelantes complejados con un ión de metal paramagnético, partículas superparamagnéticas, un agente de contraste por ultrasonidos, uno o más fotomarcadores o uno o más quelantes complejados con un radionúclido.

5. Compuesto según la reivindicación 4, en el que el radionúclido es 18F, 124I, 125I, 131I, 123I, 77Br, 76Br, 99mTc, 51Cr,

67Ga, 68Ga, 47Sc, 51Cr, 167Tm, 141Ce, 111In, 168Yb, 175Yb, 140La, 90Y, 88Y, 153Sm, 166Ho, 185Dy, 168Dy, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 97Ru, 103Ru, 188Re, 188Re, 203Pb, 211Bi, 212Bi, 213Bi, 214Bi, 105Rh, 109Pd, 117mSn, 149Pm, 161Tb, 177Lu, 198Au o 199Au.

6. Compuesto según la reivindicación 3, en el que el grupo de marcaje comprende

un grupo detectable mediante obtención de imágenes óptica y el parámetro óptico detectado se selecciona del grupo que consiste en radiación transmitida, absorción, emisión fluorescente o fosforescente, reflexión de luz, cambios en la absorbancia, amplitud o máximos, y radiación dispersada de manera elástica,

o un fotomarcador comprende un colorante óptico, opcionalmente un fluoróforo o cromóforo orgánico.

7. Compuesto según la reivindicación 3, que comprende además un ligador entre el compuesto multivalente y el

grupo de marcaje o agente terapéutico, comprendiendo preferiblemente el ligador una cadena de alquilo sustituida, una cadena de alquilo no sustituida, un derivado de polietilenglicol, un espaciador de aminoácido, un azúcar, un espaciador alifático, un espaciador aromático, una molécula lipídica, o combinación de los mismos.

8. Compuesto según la reivindicación 5, en el que el quelante se selecciona del grupo que consiste en: 20

enlosqueXesCH2uO;

Y es alquilo ramificado o no ramificado C1-C10, arilo, ariloxilo, arilamino, arilaminoacilo o aralquilo que comprende grupos alquilo ramificados o no ramificados C1-C10, grupos hidroxi o polihidroxialquilo o grupos polialcoxialquilo o polihidroxi-polialoxialquilo ramificados o no ramificados C1-C10;

J es C (=O) -, OC (=O) -, SO2-, NC (=O) -, NC (=S) -, N (Y) , NC (=NCH3) -, NC (=NH) -, N=N-, una homopoliamida o una heteropoliamina derivada de aminoácidos sintéticos o que se producen de manera natural;

y n es 1-100; y el quelante se compleja opcionalmente co.

99. Tc, 188Re o 188Re el quelante tiene la siguiente estructura:

y el quelante se compleja opcionalmente con 99mTc o el quelante se selecciona del grupo que consiste en:

en los que R es un grupo alquilo y el quelante se compleja opcionalmente con 177Lu, 90Y, 153Sm, 111In o 168Ho. 5

9. Compuesto según la reivindicación 8, conjugado con un quelante, en el que el compuesto multivalente conjugado con un quelante se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en D17, D26, D31.

10. Compuesto según la reivindicación 1, en el que dicho dímero comprende: 10

que comprende además opcionalmente al menos un grupo de marcaje o agente terapéutico, en el que el grupo de marcaje comprende preferiblemente un grupo detectable mediante obtención de imágenes por ultrasonidos.

11. Agente de contraste por ultrasonidos que comprende o bien una vesícula conjugada con al menos un compuesto multivalente según la reivindicación 1 seleccionado del

grupo que consiste en D1, D5, D6, D7, D9, D19, D20, D22, D23, 24, D25, D27, D31, 20

o bien un material que forma vesículas usado para formar una vesícula conjugada con al menos un compuesto multivalente según la reivindicación 1 seleccionado del grupo que consiste en D1, D5, D6, D7, D9, D19, D20, D22, D23, D24, D25, D27, D31.

12. Agente según la reivindicación 11, en el que el material que forma vesículas se selecciona del grupo que consiste en tensioactivos, lípidos, esfingolípidos, oligolípidos, fosfolípidos, proteínas, polipéptidos, hidratos de carbono y materiales poliméricos sintéticos o naturales.

13. Agente según la reivindicación 11, en el que la vesícula está conjugada con el compuesto multivalente por medio de un ligador y/o el material que forma vesículas comprende uno o más fosfolípidos y está conjugado con el compuesto multivalente por medio de un ligador,

estando seleccionado el ligador preferiblemente del grupo que consiste en una cadena de alquilo sustituida, una cadena de alquilo no sustituida, un derivado de polietilenglicol, un espaciador de aminoácido, un azúcar, un espaciador alifático, un espaciador aromático, una molécula lipídica o una combinación de los mismos.

14. Compuesto multivalente que comprende dos polipéptidos que tienen especificidad por epítopos diferentes en un receptor proteína-tirosina cinasa seleccionado del grupo que consiste en KDR y cMet, en el que el compuesto se selecciona del grupo que consiste en 15. Compuesto según la reivindicación 14, en el que los polipéptidos tienen especificidad por epítopos diferentes en KDR y el compuesto se selecciona del grupo que consiste en D4, D10, D11, D12, D13, D14, D15, D16 y D21 o los polipéptidos tienen especificidad por epítopos diferentes en cMet y el compuesto se selecciona de D28, D29, D30.