Conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos.

Un conjugado de péptido-fosfolípido seleccionado a partir del grupo consistente **Fórmula**

Conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos y en particular a conjugados de péptidos específicos de una diana-fosfolípidos, que son útiles en composiciones terapéuticas y de diagnóstico y a métodos de preparación de los mismos. La invención incluye agentes de contraste para ultrasonidos dirigidos, y especialmente microburbujas dirigidas que incluyen tales conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos.

Antecedentes de la invención La angiogénesis, formación de nuevos vasos sanguíneos, se produce no solo durante el desarrollo embrionario y el crecimiento del tejido normal y la reparación, sino que también está involucrada en el ciclo reproductor femenino, el establecimiento y el mantenimiento del embarazo, y la reparación de heridas y fracturas. Además de la angiogénesis que se produce en el individuo normal, los acontecimientos angiogénicos están implicados en una serie de procesos patológicos, en particular, el crecimiento tumoral y la metástasis, y otras afecciones en las que se incrementa la proliferación de los vasos sanguíneos, tales como retinopatía diabética, psoriasis y artropatías. Además, la angiogénesis es importante en la transición de un tumor con crecimiento hiperplásico a neoplásico. Por consiguiente, la inhibición de la angiogénesis se ha convertido en un campo de investigación de una terapia activa contra el cáncer.

La angiogénesis inducida por tumores se cree que depende de la producción de factores de crecimiento proangiogénicos en las células tumorales, que superan otras fuerzas que tienden a mantener los vasos existentes inactivos y estables. El mejor caracterizado de estos agentes proangiogénicos o factores de crecimiento es el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) (Cohen et al., FASEB J., 13: 9-22 (1999) ) . El VEGF se produce de forma natural en una variedad de tipos de células como respuesta a la hipoxia y a algunos otros estímulos. Muchos tumores también producen grandes cantidades de VEGF y/o inducen a células cercanas del estroma para que produzcan VEGF (Fukumura et al., Cell, 94: 715-725 (1998) ) . El VEGF, también conocido como VEGF-A, se sintetiza como cinco isoformas diferentes por corte y empalme de 121, 145, 165, 189 y 206 aminoácidos. El VEGF121 y VEGF165 son las principales formas producidas, en particular en tumores (véase Cohen et al. 1999, supra) . El VEGF121 carece de un dominio básico codificado por los exones 6 y 7 del gen de VEGF y no se une a la heparina o a la matriz extracelular, a diferencia de VEGF165.

Los miembros de la familia de VEGF actúan principalmente uniéndose a las cinasas de tirosina receptoras. En general, las cinasas de tirosina receptoras son glicoproteínas que tienen un dominio extracelular capaz de unirse a uno o varios factores de crecimiento específicos, un dominio transmembranal (por lo general una hélice alfa) , un dominio yuxtamembranal (en donde el receptor puede estar regulado, por ejemplo, mediante fosforilación) , un dominio de cinasa de tirosina (el componente catalítico del receptor) , y una cola carboxi-terminal que en muchos receptores está implicada en el reconocimiento y la unión de los sustratos de la cinasa de tirosina. Hay tres cinasas de tirosina receptoras específicas de células endoteliales, conocidas por unirse a VEGF: VEGFR-1 (Flt-1) , VEGFR-2 (KDR o Flk1) y VEGFR-3 (Flt4) . Flt-1 y KDR (también conocidas como VEGFR-2 o Flk-1, que se utilizan indistintamente en este documento) se han identificado como los principales receptores de VEGF de alta afinidad. Aunque Flt-1 tiene una mayor afinidad hacia VEGF, KDR muestra una expresión más abundante en las células endoteliales (Bikfalvi et al.,

J. Cell. Physiol., 149: 50-59 (1991) ) . Por otra parte, se cree que KDR domina la respuesta angiogénica y por lo tanto tiene un mayor interés terapéutico y de diagnóstico (véase Cohen et al. 1999, supra) . La expresión de KDR está muy regulada al alza en los vasos angiogénicos, especialmente en tumores que inducen una fuerte respuesta angiogénica (Veikkola et al., Cancer Res., 60: 203-212 (2000) ) . El papel fundamental de KDR en la angiogénesis se destaca por la ausencia total de desarrollo vascular en embriones de ratón con genes desactivados, homocigotos para KDR (Folkman et al., Cancer Medicine, 5ª edición (B.C. Decker Inc.; Ontario, Canadá, 2000) págs. 132-152) .

KDR (región del dominio cinasa) se compone de 1336 aminoácidos en su forma madura. La forma glicosilada de KDR migra en un gel de SDS-PAGE con un peso molecular aparente de aproximadamente 205 kDa. KDR contiene siete dominios de tipo inmunoglobulina en su dominio extracelular, de los cuales, los tres primeros son los más importantes en la unión a VEGF (Cohen et. al, 1999, supra) . El propio VEGF es un homodímero capaz de unirse a dos moléculas de KDR simultáneamente. El resultado es que dos moléculas de KDR se dimerizan después de la unión y se autofosforilan, volviéndose mucho más activas. El aumento de la actividad cinasa, a su vez, inicia una vía de señalización que media en los efectos biológicos del VEGF específicos de KDR.

Por lo tanto, no solo la actividad de unión a VEGF de KDR in vivo es decisiva para la angiogénesis, sino que la capacidad de detectar la regulación al alza de KDR en las células endoteliales o de detectar complejos de unión de VEGF/KDR sería extremadamente beneficiosa para detectar o vigilar la angiogénesis.

Es bien conocido que agentes de contraste para ultrasonidos llenos de gas son reflectores de ultrasonidos excepcionalmente eficaces para la ecografía. Tales agentes de contraste para ultrasonidos incluyen, por ejemplo, microvesículas llenas de gas tales como microburbujas llenas de gas y microglobos llenos de gas. Las microburbujas llenas de gas son agentes de contraste para ultrasonidos particularmente preferidos. (En esta descripción, el término "microburbujas" designa específicamente una burbuja gaseosa rodeada o estabilizada con fosfolípidos) . Por ejemplo, la inyección en el torrente sanguíneo de suspensiones de cuerpos vivos de microburbujas llenas de aire o de gas en un vehículo líquido, reforzará fuertemente la formación de imágenes ecográficas con ultrasonidos, ayudando de este modo a la visualización de estructuras anatómicas internas. La obtención de imágenes de vasos y órganos internos puede ayudar mucho en el diagnóstico médico, por ejemplo, para la detección de enfermedades neoplásicas, cardiovasculares y otras.

El documento WO03/074005 describe polipéptidos que se unen a KDR o al complejo VEGF/KDR, que se pueden incorporar en agentes de contraste para ultrasonidos llenos de gas.

Para los fines diagnósticos y terapéuticos sería particularmente beneficioso incorporar en agentes de contraste para ultrasonidos llenos de gas, composiciones de vectores específicos de una diana que muestran una alta afinidad en la unión a una diana deseada (tal como, por ejemplo, KDR o el complejo VEGF/KDR) . Por ejemplo, los conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos y en particular los conjugados de péptidos específicos de una diana-fosfolípidos se pueden utilizar para preparar agentes de contraste para ultrasonidos dirigidos llenos de gas. Además, sería particularmente beneficioso disponer de métodos para la producción a gran escala de formas altamente purificadas de tales conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos. Tales composiciones y métodos permitirían la producción de composiciones para uso en aplicaciones de diagnóstico o terapéuticas, tales como, por ejemplo, dirigir de forma precisa a un sitio diana restos indicadores, agentes tumoricidas o inhibidores de la angiogénesis.

Compendio de la invención La presente invención proporciona conjugados de vectores específicos de una diana-fosfolípidos y en particular conjugados de péptidos específicos de una diana-fosfolípidos que son útiles en la preparación de agentes de contraste para ultrasonidos llenos de gas. En una realización preferida, los conjugados de péptidos específicos de una dianafosfolípidos incluyen péptidos específicos de una diana que muestran una alta afinidad en la unión a KDR y, por lo tanto, son componentes útiles de agentes de contraste para la formación de imágenes de procesos angiogénicos.

La presente invención también proporciona conjugados de fosfolípidos y péptidos monómeros y dímeros (también denominados en este documento como lipopéptidos) que son útiles en la preparación de agentes de contraste para ultrasonidos llenos de gas, y en particular, en la preparación de agentes de contraste para ultrasonidos que... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado de péptido-fosfolípido seleccionado a partir del grupo consistente en:

; y

2. Una composición de agente de contraste para ultrasonidos que comprende un conjugado según la reivindicación 1.

3. La composición según la reivindicación 2, en donde el agente de contraste comprende una microvesícula llena de gas.

4. La composición según la reivindicación 3, en donde la microvesícula llena de gas comprende un fosfolípido.

5. La composición según la reivindicación 3, en donde la microvesícula llena de gas comprende adicionalmente dos o más componentes seleccionados entre el grupo consistente en: DSPC, DPPG, DPPA, DSPA, DPPE, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, ácido palmítico y ácido esteárico.

6. La composición según la reivindicación 5, en donde el conjugado comprende

(i) disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K (DSPE-PEG2000-NH-Glut) ]-NH2}-NH2 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPC y DPPG;

(ii) SEQ ID NO. 4 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPC y DPPG;

(iii) SEQ ID NO. 4 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG1000, DPPE y DPPG;

(iv) disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K (DSPE-PEG2000-NH-Glut) ]-NH2}-NH2 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG1000, DPPE y DPPG;

(v) disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K (DSPE-PEG2000-NH-Glut) ]-NH2}-NH2 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG1000, DSPC y DSPA;

(vi) SEQ ID NO. 1 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG2000, DSPC y DSPA;

(vii) SEQ ID NO. 1 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPC y DSPA;

(viii) disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K (DSPE-PEG2000-NH-Glut) ]-NH2}-NH2 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG2000, DSPC y estearato;

(ix) SEQ ID NO. 1 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG2000, DSPC y estearato;

(x) disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K (DSPE-PEG2000-NH-Glut) ]-NH2}-NH2 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPC y estearato;

(xi) disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK{disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDP-GGGK[-Adoa-Adoa-Glut-K (DSPE-PEG2000-NH-Glut) ]-NH2}-NH2 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG1000, DSPC y estearato;

(xii) SEQ ID NO. 1 y el agente de contraste comprende adicionalmente DSPE-PEG1000, DSPC y estearato.

7. La composición según la reivindicación 5, que comprende adicionalmente un componente seleccionado entre el grupo consistente en: azúcares, polisacáridos y polioles.

8. La composición según la reivindicación 7, en donde dicho componente se selecciona a partir de manitol, dextrano y polietilenglicol.

9. La composición según la reivindicación 3, en donde dicho gas comprende un gas fluorado.

10. La composición según la reivindicación 9, en donde el gas comprende C2F8, C4F10 o SF6, opcionalmente en mezcla por adición de aire, nitrógeno, oxígeno o dióxido de carbono.

11. Una composición de agente de contraste para ultrasonidos que comprende un conjugado de péptidofosfolípido que comprende uno o varios péptidos monómeros seleccionados entre el grupo consistente en Ac-Arg-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2; Ac-Ala-Gln-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Asp-Glu-Ile-Leu-Ser-Met-Ala-Asp-Gln-Leu-Arg-His-Ala-Phe-Leu-Ser-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Lys-NH2; disulfuro cíclico (6-13) de Ac-Ala-Gly-Pro-Thr-Trp-Cys-Glu-Asp-Asp-Trp-Tyr-Tyr-Cys-Trp-Leu-Phe-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Lys (ivDde) -NH2 y disulfuro cíclico (2-12) de Ac-Val-Cys-Trp-Glu-Asp-Ser-Trp-Gly-Gly-Glu-Val-Cys-Phe-Arg-Tyr-Asp-Pro-Gly-Gly-Gly-Lys (Adoa-Adoa) -NH2.

12. La composición según la reivindicación 11, en donde el agente de contraste comprende una microvesícula llena de gas.

13. La composición según la reivindicación 12, en donde dicho gas comprende un gas fluorado.

14. La composición según la reivindicación 12, que comprende adicionalmente dos o varios componentes seleccionados entre el grupo consistente en: DSPC, DPPG, DPPA, DSPA, DPPE, DSPE-PEG1000, DSPE-PEG2000, ácido palmítico y ácido esteárico.

15. La composición según la reivindicación 14, en donde el gas comprende C3F8, C4F10 o SF6, opcionalmente en mezcla por adición de aire, nitrógeno, oxígeno o dióxido de carbono.

16. El conjugado de péptido-fosfolípido según la reivindicación 12, en donde el fosfolípido se selecciona entre el grupo que consiste en: fosfatidiletanolaminas, fosfatidiletanolaminas modificadas y DSPE-PEG2000.

17. Un método para preparar una microvesícula llena de gas que comprende un fosfolípido que comprende las etapas de:

a. preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso que incluye agua, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible en agua, iii) un fosfolípido, iv) un conjugado de péptidofosfolípido según la reivindicación 1 y v) un agente lioprotector;

b. liofilizar dicha emulsión para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido;

c. poner en contacto dicha matriz liofilizada con un gas biocompatible;

d. reconstituir dicha matriz liofilizada disolviéndola en un líquido portador acuoso fisiológicamente aceptable, para obtener una suspensión de dichas microvesículas llenas de gas.

18. El método según la reivindicación 17, en donde la etapa a comprende las etapas de:

a1. preparar una suspensión acuosa que comprende un fosfolípido pegilado y el conjugado según la reivindicación 1; a2. preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende el medio acuoso, el disolvente orgánico, el fos

folípido y el agente lioprotector; y a3. mezclar por adición dicha suspensión acuosa de la etapa a1 con la emulsión de la etapa a2.

19. Un método para preparar un conjugado de péptido y fosfolípido que comprende conjugar un péptido selec

cionado entre el grupo consistente en SEQ ID NO. 2, disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K (ivDde) ]-NH2, disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (Adoa-Adoa) -NH2, SEQ ID NO. 5 y disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (-Adoa-Adoa

Glut-K) -NH2]-NH2 con un fosfolípido.

20. El método según la reivindicación 19, en donde el fosfolípido es DSPE-PEG2000-NH2.

21. El método según la reivindicación 20, en donde la conjugación comprende hacer reaccionar un mono-éster de NHS del péptido con un grupo amino libre de la sal del fosfolípido.

22. Un método para preparar un conjugado de péptido y fosfolípido que tiene niveles bajos de TFA que com10 prende las etapas de:

convertir las sales de TFA del péptido dímero en una sal acetato a través de intercambio aniónico; y

conjugar el péptido dímero con un fosfolípido,

en donde el péptido comprende disulfuro cíclico (6-13) de Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[disulfuro cíclico (212) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (-Adoa-Adoa-Glut-K) -NH2]-NH2.

23. Un método para preparar un conjugado de péptido-fosfolípido que tiene niveles bajos de TFA que comprende eluir un conjugado de péptido-fosfolípido y iones de TFA en una columna de exclusión por tamaño, en donde el conjugado de péptido-fosfolípido comprende un péptido dímero o monómero seleccionado entre el grupo consistente en disulfuro cíclico (6-13) Ac-AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (-Adoa-Adoa-Glut-K) -NH2]-NH2; SEQ ID NO.2, disulfuro cíclico (6-13) de Ac

AGPTWCEDDWYYCWLFGTGGGK[K (ivDde) ]-NH2, disulfuro cíclico (2-12) de Ac-VCWEDSWGGEVCFRYDPGGGK (Adoa-Adoa) -NH2 y SEQ ID NO. 5.