Método para preparar una matriz liofilizada que, tras entrar en contacto con un líquido portador acuoso y un gas,

es reconstituible en una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso incluyendo agua, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) una composición emulsionante de materiales anfífilos que comprende más del 50% en peso de un fosfolípido y iv) un agente lioprotector; b) liofilizar dicha mezcla emulsionada, para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una formulación liofilizada o seca útil para preparar un gas que contiene agente de contraste que puede usarse en la obtención de imágenes de diagnóstico y a un procedimiento para preparar dicho gas que contiene agente de contraste.

La invención también incluye formulaciones secas preparadas mediante este procedimiento, que pueden reconstituirse para formar suspensiones de agente de contraste útiles en la obtención de imágenes de diagnóstico. La invención incluye además suspensiones de microburbujas llenas de gas útiles en la obtención de imágenes de diagnóstico preparadas usando formulaciones secas de la invención así como envases o kits de dos componentes que contienen las formulaciones secas de la invención.

Antecedentes de la invención

El rápido desarrollo de los agentes de contraste para ultrasonido en los últimos años ha generado varias formulaciones diferentes, que son útiles en la obtención de imágenes por ultrasonido de órganos y tejido del cuerpo humano o de animales. Estos agentes están diseñados para usarse fundamentalmente como productos inyectables intravenosos o intra-arteriales conjuntamente con el uso de equipos ecográficos médicos que emplean, por ejemplo, obtención de imágenes en modo B (basándose en la distribución espacial de las propiedades de tejidos de retrodispersión) o procesamiento de señales Doppler (basándose en el procesamiento Doppler de impulsos o de onda continua de ecos ultrasónicos para determinar parámetros de flujo de un líquido o la sangre).

Una clase de formulaciones inyectables útiles como agentes de contraste para ultrasonido incluye suspensiones de burbujas

de gas que tienen un diámetro de unas pocas micras dispersadas en un medio acuoso.

El uso de suspensiones de burbujas de gas en un líquido portador, como reflectores de ultrasonido eficientes se conoce bien en la técnica. El desarrollo de suspensiones de microburbujas como productos farmacéuticos para ecografía para mejorar la obtención de imágenes por ultrasonido siguió las observaciones tempranas de que inyecciones intravenosas rápidas de disoluciones acuosas pueden provocar que gases disueltos salgan de la disolución formando burbujas. Debido a su diferencia sustancial en impedancia acústica en relación con la sangre, se encontró que estas burbujas de gas intravasculares eran reflectores excelentes de ultrasonido. La inyección de suspensiones de burbujas de gas en un líquido portador en la corriente sanguínea de un organismo vivo refuerza fuertemente la obtención de imágenes por ecografía de ultrasonido, mejorando así la visualización de los órganos internos. Dado que la obtención de imágenes de órganos y tejidos arraigados profundamente puede ser crucial en el establecimiento de un diagnóstico médico, se ha dedicado un gran esfuerzo al desarrollo de suspensiones estables de burbujas de gas altamente concentradas que al mismo tiempo serían fáciles de preparar y administrar, contendrían una cantidad mínima de especies inactivas y podrían tener un almacenamiento largo y una distribución simple.

Sin embargo, la dispersión simple de burbujas de gas libres en el medio acuoso es de interés práctico limitado, dado que, en general, estas burbujas no son suficientemente estables para ser útiles como agentes de contraste para ultrasonido.

Por consiguiente, se ha mostrado interés en métodos de estabilización de burbujas de gas para ecografía y otros estudios ultrasónicos, por ejemplo usando emulsionantes, aceites, espesantes o azúcares, o atrapando o encapsulando el gas o un precursor del mismo en una variedad de sistemas. Estas burbujas de gas estabilizadas se denominan generalmente en la técnica “microvesículas”, y pueden dividirse en dos categorías principales.

Una primera categoría de microvesículas o burbujas estabilizadas se denomina generalmente en la técnica “microburbujas” e incluye suspensiones acuosas en las que las burbujas de gas están unidas en la interfase gas/líquido por una envoltura muy delgada que implica un tensioactivo (es decir un material anfífilo) dispuesto en la interfase gas-líquido. Una segunda categoría de microvesículas se denomina generalmente en la técnica “microglobos” o “microcápsulas” e incluye suspensiones en las que las burbujas de gas están rodeadas por una envoltura de material sólido formada por polímeros sintéticos o naturales. Se dan a conocer ejemplos de microglobos y de la preparación de los mismos, por ejemplo, en la solicitud de patente europea EP 0458745. Otro tipo de agente de contraste para ultrasonido incluye suspensiones de micropartículas porosas de polímeros u otros sólidos, que portan burbujas de gas atrapadas dentro de los poros de las micropartículas. La presente invención se refiere particularmente a agentes de contraste para la obtención de imágenes de diagnóstico que incluyen una suspensión acuosa de microburbujas de gas, es decir microvesículas que se estabilizan esencialmente por una capa de material anfífilo.

Normalmente, las suspensiones de microburbujas se preparan poniendo en contacto materiales anfífilos en polvo, por ejemplo liposomas preformados liofilizados o suspensiones de fosfolípidos secadas por pulverización o liofilizadas, con aire u otro gas y después con un portador acuoso, agitando para generar una suspensión de microburbujas que entonces debe administrarse poco después de su preparación.

Pueden encontrarse ejemplos de suspensiones acuosas de microburbujas de gas y la preparación de las mismas, por ejemplo, en los documentos US 5.271.928, US 5.445.813, US 5.413.774, US 5.556.610, 5.597.549, US 5.827.504.

El documento WO97/29783 da a conocer un procedimiento alternativo para preparar suspensiones de microburbujas de gas, que comprende generar una dispersión de microburbujas de gas en un medio acuoso que contiene fosfolípido apropiado y después someter la dispersión a liofilización para producir un producto

reconstituible secado. Los productos secados así preparados son reconstituibles en medios acuosos requiriendo sólo mínima agitación. Tal como se menciona en dicho documento, el tamaño de las microburbujas así generadas puede reproducirse de manera consistente y en la práctica es independiente de la cantidad de energía de agitación aplicada durante su reconstitución, determinándose por el tamaño de las microburbujas formadas en la dispersión de microburbujas inicial. Sin embargo, el solicitante ha observado que la cantidad de energía de agitación aplicada para generar la dispersión de microburbujas de gas en el medio acuoso que contiene fosfolípido puede ser excesivamente alta, particularmente cuando deben obtenerse microburbujas de diámetro pequeño (por ejemplo 23000 rpm durante 10 minutos, para obtener una dispersión de burbujas que tienen un diámetro medio en

volumen de aproximadamente 3 m). Esta alta energía de agitación puede determinar un sobrecalentamiento local en la dispersión acuosa de microburbujas, lo que a su vez puede provocar una degradación de los fosfolípidos contenidos en el medio acuoso. Además, en general los efectos de una energía de agitación excesivamente alta son difíciles de controlar y pueden dar como resultado una distribución de tamaño incontrolable de las microburbujas finales. Además, este procedimiento implica un flujo continuo de gas hacia el medio acuoso durante la generación de las microburbujas, requiriendo por tanto el uso de cantidades relevantes de gases.

El documento WO 94/01140 da a conocer un procedimiento adicional para preparar suspensiones de microvesículas reconstituibles en un medio acuoso, que comprende liofilizar emulsiones acuosas que contienen emulsionantes parenteralmente aceptables, líquidos no polares y “formadores de estructura” insolubles en agua o solubles en lípidos. Los poloxámeros y fosfolípidos se mencionan como emulsionantes parenteralmente aceptables, aunque se emplean mezclas de estos dos en los ejemplos de trabajo. El colesterol es el formador de estructura insoluble en agua preferido, que se emplea en los ejemplos de trabajo. Entonces, el producto liofilizado se reconstituye en

agua, para dar una suspensión acuosa de microvesículas llenas de gas. Por tanto, las microvesículas llenas de gas que resultan de la etapa de reconstitución están definidas por una envoltura de diferentes materiales, incluyendo emulsionantes tales como poloxámeros y formadores de estructura insolubles...

1. Método para preparar una matriz liofilizada que, tras entrar en contacto con un líquido portador acuoso y un gas, es reconstituible en una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por un fosfolípido, comprendiendo dicho método las etapas de: a) preparar una emulsión acuosa-orgánica que comprende i) un medio acuoso incluyendo agua, ii) un disolvente orgánico sustancialmente inmiscible con agua; iii) una composición emulsionante de materiales anfífilos que comprende más del 50% en peso de un fosfolípido y iv) un agente lioprotector;

b) liofilizar dicha mezcla emulsionada, para obtener una matriz liofilizada que comprende dicho fosfolípido.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa a) de preparar la emulsión comprende las siguientes etapas: a1) preparar una suspensión dispersando la composición

emulsionante y el agente lioprotector en el medio acuoso; a2) mezclar la suspensión obtenida con el disolvente orgánico; a3) someter la mezcla a agitación controlada, para obtener una emulsión.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua inferior a 10 g/l.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de 1,0 g/l o inferior.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de 0,2 g/l o inferior.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de aproximadamente 0,01 g/l o inferior.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el disolvente orgánico tiene una solubilidad en agua de 0,001 g/l o inferior.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el disolvente orgánico se selecciona entre alcanos lineales o ramificados, alquenos, ciclo-alcanos, hidrocarburos aromáticos, alquil éteres, cetonas, hidrocarburos halogenados, hidrocarburos perfluorados y mezclas de los mismos.

9. Método según la reivindicación 8, en el que el disolvente se selecciona entre pentano, hexano, heptano, octano, nonano, decano, 1-penteno, 2-penteno, 1-octeno, ciclopentano, ciclohexano, ciclooctano, 1-metilciclohexano, benceno, tolueno, etilbenceno, 1,2dimetilbenceno, 1,3-dimetilbenceno, di-butil éter y diisopropilcetona, cloroformo, tetracloruro de carbono, 2cloro-1-(difluorometoxi)-1,1,2-trifluoroetano (enflurano), 2-cloro-2-(difluorometoxi)-1,1,1-trifluoroetano (isoflurano), tetracloro-1,1-difluoroetano, perfluoropentano, perfluorohexano, perfluoroheptano, perfluorononano, perfluorobenceno, perfluorodecalina, metilperfluorobutil éter, metilperfluoroisobutil éter, etilperfluorobutil éter, etilperfluoroisobutil éter y mezclas de los mismos.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cantidad de disolvente orgánico es desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 50% en volumen con respecto a la cantidad de agua.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el agente de lioprotección se selecciona entre hidratos de carbono, alcoholes de azúcar, poliglicoles y mezclas de los mismos.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el agente de lioprotección se selecciona entre glucosa, galactosa, fructosa, sacarosa, trehalosa, maltosa, lactosa, amilosa, amilopectina, ciclodextrinas, dextrano, inulina, almidón

soluble, hidroxietil-almidón (HES), eritritol, manitol, sorbitol, polietilenglicoles y mezclas de los mismos.

13. Método según la reivindicación 11 ó 12, en el que la cantidad de agente de lioprotección es desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 25% en peso con respecto al peso del agua.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el fosfolípido se selecciona entre dilauroilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil-fosfatidilcolina (DMPC), dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC), diaraquidoilfosfatidilcolina (DAPC), diestearoil-fosfatidilcolina (DSPC), dioleoil-fosfatidilcolina (DOPC), 1,2-diestearoilsn-glicero-3-etilfosfocolina (etil-DSPC), dipentadecanoilfosfatidilcolina (DPDPC), 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (MPPC), 1-palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina (PMPC), 1-palmitoil-2-estearoilfosfatidilcolina (PSPC), 1-estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (SPPC), 1-palmitoil-2ºleilfosfatidilcolina (POPC), 1-oleil-2-palmitoilfosfatidilcolina (OPPC), dilauroil-fosfatidilglicerol (DLPG) y sus sales de metales alcalinos, diaraquidoilfosfatidil-glicerol (DAPG) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) y sus sales de metales alcalinos, dipalmitoilfosfatidilglicerol (DPPG) y sus sales de metales alcalinos, diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG) y sus sales de metales alcalinos, dioleoilfosfatidilglicerol (DOPG) y sus sales de metales alcalinos, ácido dimiristoilfosfatídico (DMPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido dipalmitoil-fosfatídico (DPPA) y sus sales de metales alcalinos, ácido diestearoil-fosfatídico (DSPA), ácido diaraquidoilfosfatídico (DAPA) y sus sales de metales alcalinos, dimiristoil-fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoilfosfatidiletanolamina (DPPE), diestearoilfosfatidil-etanolamina (DSPE), dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE), diaraquidoilfosfatidiletanolamina (DAPE), dilinoleilfosfatidiletanolamina (DLPE),

dimiristoil-fosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DMPE-PEG), dipalmitoilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DPPE-PEG), diestearoil-fosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DSPE-PEG), dioleilfosfatidil-etanolamina modificada con polietilenglicol (DOPE-PEG), diaraquidoilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DAPE-PEG), dilinoleilfosfatidiletanolamina modificada con polietilenglicol (DLPE-PEG), dimiristoil-fosfatidilserina (DMPS), diaraquidoil-fosfatidilserina (DAPS), dipalmitoilfosfatidilserina (DPPS), diestearoilfosfatidilserina (DSPS), dioleoilfosfatidilserina (DOPS), dipalmitoilesfingomielina (DPSP) y diestearoilesfingomielina (DSSP) y mezclas de los mismos.

15. Método según la reivindicación 1, en el que la composición emulsionante de materiales anfífilos comprende un fosfolípido y un material anfífilo que lleva una carga neta global.

16. Método según la reivindicación 1, 2 ó 14, en el que la cantidad de fosfolípido es desde aproximadamente el 0,005% hasta aproximadamente el 1,0% en peso con respecto al peso total de la mezcla emulsionada.

17. Método según la reivindicación 16, en el que la cantidad de fosfolípido es desde el 0,01% hasta el 1,0% en peso con respecto al peso total de la mezcla emulsionada.

18. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que el fosfolípido incluye un ligando de direccionamiento o un grupo reactivo protector que puede reaccionar con un ligando de direccionamiento.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 15 ó 16, en el que la emulsión contiene además un material anfífilo seleccionado de lisolípidos; ácidos grasos y sus sales respectivas con metales alcalinos o álcali; lípidos que llevan polímeros; lípidos que llevan mono, di, oligo o polisacáridos sulfonatados; lípidos con ácidos grasos con

uniones éster o éter; lípidos polimerizados; fosfato de diacetilo; fosfato de dicetilo; estearilamina; ceramidas; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno; alcoholes grasos de polioxietileno; éteres de alcoholes grasos de polioxietileno; ésteres de ácidos grasos de sorbitano polioxietilado; ricinoleato de polietilenglicol y glicerol; esteroles de soja etoxilados; aceite de ricino etoxilado; copolímeros de bloque de óxido de etileno (EO) y óxido de propileno (PO); ésteres de ácidos de azúcares de esteroles; ésteres de azúcares con ácidos alifáticos; ésteres de glicerol con ácidos grasos dicarboxílicos (C12-C24) y sus sales respectivas con sales de metales alcalinos o álcali; saponinas; alcoholes de cadena larga (C12-C24); 6-(5

colesten-3-iloxi)-1-tio--D-galactopiranósido; digalactosildiglicérido; 6-(5-colesten-3-iloxi)hexil-6amino-6-desoxi-1-tio--D-galactopiranósido; 6-(5-colesten3-iloxi)hexil-6-amino-6-desoxil-1-tio--D-manopiranósido;

á c i d o 1 2-(((7'-dietilaminocumarin-3il)carbonil)metilamino)octadecanoico; ácido N-[12-(((7'dietilaminocumarin-3-il)carbonil)metilamino)-octadecanoil]2-aminopalmítico; N-succinildioleilfosfatidiletanolamina; 1-hexadecil-2-palmitoilglicerofosfoetanolamina; palmitoilhomocisteína; sales de alquilamonio que comprenden al menos una cadena de alquilo (C10-C20); sales de amonio cuaternario o terciario que comprenden al menos una cadena de acilo (C10-C20) unida al átomo de N a través de un puente de alquileno (C3-C6): y mezclas o combinaciones de los mismos.

20. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la emulsión acuosa-orgánica de la etapa a) se somete a una etapa de lavado antes de la etapa de liofilización b).

21. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la emulsión acuosa-orgánica de la etapa a) se somete a una etapa de microfiltración antes de la etapa de liofilización b).

22. Método según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además añadir una suspensión acuosa que comprende un compuesto anfífilo adicional a la emulsión acuosa-orgánica obtenida según la etapa a), antes de la etapa de liofilización b), obteniendo así una segunda emulsión acuosa-orgánica que comprende dicho compuesto anfífilo adicional.

23. Método según la reivindicación 22, que comprende además calentar la mezcla de dicha suspensión acuosa y de dicha emulsión acuosa-orgánica.

24. Método según la reivindicación 23, en el que dicha mezcla se calienta a una temperatura de desde aproximadamente 40ºC hasta aproximadamente 80ºC.

25. Método según la reivindicación 22, en el que dicho compuesto anfífilo es un fosfolípido modificado con PEG, un fosfolípido modificado con PEG que lleva un resto reactivo

o un fosfolípido modificado con PEG que lleva un ligando de direccionamiento.

26. Método según la reivindicación 1, 2 ó 22, que comprende además, antes de la etapa de liofilización b), someter la emulsión acuosa-orgánica a un calentamiento controlado.

27. Método según la reivindicación 26, en el que dicho calentamiento controlado se efectúa a una temperatura de desde aproximadamente 60ºC hasta 125ºC.

28. Método según la reivindicación 27, en el que dicho calentamiento controlado se efectúa a una temperatura de desde aproximadamente 80ºC hasta 120ºC.

29. Método según la reivindicación 27, en el que dicha emulsión está contenida en un vial sellado.

30. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además las etapas de: c) poner en contacto dicha matriz liofilizada con un gas

biocompatible; y

d) reconstituir dicha matriz liofilizada disolviéndola en un líquido portador acuoso fisiológicamente aceptable, para obtener una suspensión de microburbujas llenas de gas estabilizadas predominantemente por dicho fosfolípido.

31. Método según la reivindicación 30, en el que el gas biocompatible se selecciona entre aire; nitrógeno; oxígeno; dióxido de carbono; hidrógeno; óxido nitroso; gases inertes; un hidrocarburo de bajo peso molecular, incluyendo un alcano (C1-C7), un cicloalcano (C4-C7), un alqueno (C2-C7) y un alquino (C2-C7); un éter; una cetona; un éster; un éter, cetona o hidrocarburo (C1-C7) halogenado; o una mezcla de cualquiera de los anteriores.

32. Método según la reivindicación 31, en el que el gas de hidrocarburo halogenado se selecciona entre bromoclorodifluoro-metano, clorodifluorometano, diclorodifluoro-metano, bromotrifluorometano, clorotrifluorometano, cloropentafluoroetano, diclorotetrafluoroetano y mezclas de los mismos.

33. Método según la reivindicación 31, en el que el gas de hidrocarburo halogenado es un hidrocarburo perfluorado.

34. Método según la reivindicación 33, en el que el gas de hidrocarburo perfluorado es perfluorometano, perfluoroetano, un perfluoropropano, un perfluorobutano, un perfluoropentano, un perfluorohexano, un perfluoroheptano; perfluoropropeno, un perfluorobuteno, perfluorobutadieno, perfluorobut-2-ino, perfluorociclobutano, perfluorometilciclobutano, un perfluorodimetilciclobutano, un perfluorotrimetilciclobutano, perfluorociclopentano, perfluorometilciclopentano, un perfluorodimetilciclopentano, perfluorociclohexano, perfluorometilciclohexano, perfluorocicloheptano o mezclas de los mismos.

35. Método según una cualquiera de las reivindicaciones

anteriores 30 a 34, en el que dichas microburbujas tienen un diámetro medio en número (DN) inferior a 1,70 m y una mediana del diámetro en volumen (DV50) tal que la razón de DV50/DN es de aproximadamente 2,00 o inferior.

36. Método según la reivindicación 35, en el que dichas microburbujas tienen un valor de DN de 1,60 m o inferior,

preferiblemente de 1,50 m o inferior, más preferiblemente de 1,30 m o inferior.

37. Método según la reivindicación 35, en el que dichas microburbujas tienen una razón de DV50/DN de aproximadamente 1,80 o inferior, preferiblemente de aproximadamente 1,60 o inferior, más preferiblemente de aproximadamente 1,50 o inferior.