Composiciones y procedimientos para inhibir PDGFR beta y VEGF-A.

Un anticuerpo biespecífico que neutraliza tanto PDGFRb como VEGF-A,

comprendiendo dicho anticuerpo biespecífico:

(I) una primera región de unión a antígeno que se une específicamente al dominio extracelular de PDGFRb y neutraliza la actividad PDGFRb, en donde dicha región de unión a PDGFRb comprende un dominio VL (VL-PDGFR) que comprende las CDR LCDR1PDGFR, LCDR2PDGFR y LCDR3PDGFR y un dominio VH (VH-PDGFR) que comprende las CDR HCDR1PDGFR, HCDR2PDGFR y HCDR3PDGFR, en donde:

LCDR1PDGFR, LCDR2PDGFR y LCDR3PDGFR tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los restos 24-40, los restos 56-62 y los restos 95-103 de la SEC ID Nº 46; y

HCDR1PDGFR, HCDR2PDGFR y HCDR3PDGFR tienen las secuencias de aminoácidos mostradas,

respectivamente, en los restos 31-35, los restos 50-66, y los restos 99-111 de la SEC ID Nº 48; y (II) una segunda región de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF-A y neutraliza la actividad VEGF-A, en donde dicha región de unión a VEGF-A comprende un dominio VL (VL-VEGF) que comprende las CDR LCDR1VEGF, LCDR2VEGF y LCDR3VEGF y un dominio VH (VHVEGF) que comprende las CDR HCDR1VEGF, HCDR2VEGF y HCDR3VEGF, en donde:

LCDR1VEGF, LCDR2VEGF y LCDR3VEGF tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los restos 24-34, los restos 50-56 y los restos 89-97 de la SEC ID Nº 278; y

HCDR1VEGF, HCDR2VEGF y HCDR3VEGF tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los restos 31-35, los restos 50-66 y los restos 99-110 de la SEC ID Nº 280;

en donde dicha primera región de unión a antígeno y dicha segunda región de unión a antígeno muestran, cada una, una afinidad de unión (Ka) de 108 M-1 o mayor.

Composiciones y procedimientos para inhibir PDGFR beta y VEGF-A

Antecedentes de la invención 1. Angiogénesis La angiogénesis, también llamada neovascularización, implica la formación de brotes desde vasos sanguíneos preexistentes y su invasión en el tejido adyacente. Durante la angiogénesis, las células del endotelio vascular vuelven a entrar en el ciclo celular, degradan la membrana basal subyacente, y migran para formar nuevos brotes capilares. Estas células después se diferencian, y se forman vasos maduros. Este proceso de crecimiento y diferenciación está regulado por un equilibrio de factores pro-angiogénicos y anti-angiogénicos. Un proceso relacionado, la vasculogénesis, implica la diferenciación de células endoteliales y angioblastos que ya están presentes en todo un tejido, y su posterior unión para formar vasos sanguíneos.

La angiogénesis sucede de forma extensiva durante el desarrollo, y también sucede en el organismo sano durante la curación de heridas para restaurar el flujo sanguíneo a los tejidos después de lesión o herida. La angiogénesis, sin embargo, también se ha implicado en el desarrollo de ciertas enfermedades, incluyendo cáncer y formación de tumores. De hecho, la cantidad de vasos sanguíneos en un tejido tumoral es un fuerte indicador pronóstico negativo en cáncer de mama (Weidner y col., J. Nat/. Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992) , cáncer de próstata (Weidner y col., Am. J. Pathol. 143:401-409, 1993) , tumores cerebrales (Li y col., Lancet 344:82-86, 1904) , y melanoma (Foss y col., Cancer Res. 56:2900-2903, 1996) . La angiogénesis también se ha implicado recientemente en otras patologías en muchas áreas de medicina, incluyendo reumatología, dermatología, cardiología y oftalmología. En particular, la angiogénesis específica de tejido indeseable o patológica se ha asociado con ciertas patologías específicas incluyendo, por ejemplo, artritis reumatoide, aterosclerosis, psoriasis, retinopatía diabética, y degeneración macular. (Véase, por ejemplo, Fan y col., Trends Pharmacol. Sci. 16:57, 1995; Folkman, Nature Med. 1:27, 1995.) Además, se cree que la alteración de la permeabilidad vascular desempeña una tarea en procesos fisiológicos tanto normales como patológicos (Cullinan-Bove y col., Endocrinol. 133:829, 1993; Senger y col., Cancer and Metastasis Reviews 12:303, 1993) . Aunque el proceso angiogénico en cada una de estas enfermedades probablemente comparte muchas características con la angiogénesis del desarrollo y la angiogénesis tumoral, cada uno también puede tener aspectos únicos conferidos por la influencia de las células adyacentes.

Se han identificado múltiples mediadores moleculares de angiogénesis incluyendo factores de crecimiento de fibroblastos básicos y ácidos (aFGF, bFGF) , factores de crecimiento transformante alfa y beta (TGFα, TGFβ) , factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , angiogenina, factor de crecimiento de células endoteliales derivado de plaquetas (PD-ECGF) , interleuquina-8 (IL-8) , y factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) . Otros estimuladores implicados en la angiogénesis incluyen angiopoyetina-1, Del-1, folistatina, factor estimulador de colonias de granulocitos (G-CSF) , factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) , leptina, midquina, factor de crecimiento placentario, pleiotrofina (PTN) , progranulina, proliferina, y factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-alfa) . Además, el control de la angiogénesis está mediado adicionalmente por varios reguladores negativos de la angiogénesis producidos por el organismo incluyendo angioarrestina, angiostatina (fragmento de plasminógeno) , antitrombina III antiangiogénica, inhibidor derivado de cartílago (CDI) , fragmento del complemento CD59, endostatina (fragmento de colágeno XVIII) , fragmento de fibronectina, gro-beta, heparinasas, fragmento de heparina hexasacárido, gonadotropina coriónica humana (hCG) , interferón alfa/beta/gamma, proteína inducible por interferón (IP-10) , interleuquina-12, dominio kringle 5 (fragmento de plasminógeno) , inhibidores de metaloproteinasa (TIMP) , 2metoxiestradiol, inhibidor de ribonucleasa placentaria, inhibidor del activador de plasminógeno, factor plaquetario-4 (PF4) , fragmento de 16 kD de prolactina, proteína relacionada con proliferina (PRP) , retinoides, tetrahidrocortisol-S, trombospondina-1 (TSP-1) , vasculostatina, y vasostatina (fragmento de calreticulina) .

Entre estos reguladores angiogénicos, parece que VEGF desempeña una tarea clave como regulador positivo de la angiogénesis anormal que acompaña al crecimiento tumoral (revisado en Brown y col., Control of Angiogenesis (Goldberg y Rosen, eds., 1996) ; Birkhauser y col., J. Biol. Chem. 271:603-606, 1996) . Además, recientemente a estado en investigación el papel de la familia de PDGF de moléculas de señalización, ya que parece que desempeña una tarea en la formación, expansión y función apropiada de las células perivasculares, a veces mencionadas como células murales, por ejemplo, músculo liso vascular, células mesangiales, y pericitos.

II. VEGF-A

El VEGF-A (secuencias polinucleotídica y polipeptídica mostradas en las SEC ID Nº 1 y 2, respectivamente) es una glucoproteína homodimérica unida por disulfuro, secretada que pertenece al grupo de VEGF/PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas) de la superfamilia de nudo de cistina de hormonas y moléculas de señalización extracelular (véase, Vitt y col., Mol. Endocrinol., 15:681-694, 2001) , que se caracterizan todas por la presencia de ocho restos conservados de cisteína que forman la estructura típica de nudo de cistina (llamado después cistina, un dímero de dos cisteínas unidas por un enlace disulfuro) . Se han descrito cinco isoformas humanas de VEGF-A de 121, 145, 165, 189 ó 206 aminoácidos de longitud (VEGF-A121-206) , codificadas por distintas variantes de corte y ayuste del ARNm, todas las cuales son capaces de estimular la mitogénesis en células endoteliales. Estas isoformas difieren en actividad biológica, especificidad de receptor, y afinidad por proteoglicanos de heparán-sulfato asociados a superficie celular y matriz extracelular, que se comportan como receptores de baja afinidad para VEGF-A: VEGF-A121 no se une ni a heparina ni a heparán-sulfato; VEGF-A145 y VEGF-A165 (Nº Acc. GenBank M32977) son ambas capaces de unirse a heparina; y VEGF-A189 y VEGF-A206 muestran la mayor afinidad por heparina y heparán-sulfato. VEGF-A121, VEGF-A145, y VEGF-A165 se secretan en forma soluble, aunque la mayor parte de VEGF-A165 está confinada a proteoglicanos de superficie celular y matriz extracelular, mientras que VEGF-A189 y VEGF-A206 permanecen asociadas con la matriz extracelular. Tanto VEGF-A189 y VEGF-A206 pueden liberarse por tratamiento con heparina o heparinasa, lo que indica que estas isoformas están unidas a la matriz extracelular mediante proteoglicanos. VEGF-A189 unido a células también puede escindirse mediante proteasas tales como plasmina, provocando la liberación en de un VEGF-A110 soluble activo.

Se observa que la mayoría de los tejidos que expresan VEGF-A expresan varias isoformas de VEGF-A simultáneamente, aunque VEGF-A121 y VEGF-A165 son las formas predominantes, mientras que VEGF-A206 se detecta raramente (véase, Ferrara, J. Mol. Med. 77:527-543, 1999) . VEGF-A145 difiere en que se expresa principalmente en células derivadas de órganos reproductores (véase, Neufeld y col., FASEB J. 13:9-22, 1999) . VEGF-A165 humana, la forma más abundante y biológicamente activa, está glucosilada en Asn74 y normalmente se expresa como un homodímero de 46 kDa de subunidades de 23 kDa.

Se han identificado cuatro receptores de superficie celular que interaccionan con VEGF-A. Éstos incluyen VEGFR1/Flt-1 (tirosina quinasa-1 tipo fins; Nº Acc. GenBank X51602; De Vries y col., Science 255:989-991, 1992) ; VEGFR2/KDR/Flk-1 (receptor que contiene dominio de inserción de quinasa/quinasa hepática fetal-1; Nº Acc. GenBank X59397 (Flk-1) y L04947 (KDR) ; Terman y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 187:1579-1586, 1992; Matthews y col., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:90269030, 1991) ; neuropilina-1 (Nº Acc. GenBank NM003873) , y neuropilina-2 (Nº Acc. GenBank NM003872) . VEGF121 y VEGF165 se unen a VEGFR-1; VEGF121, VEGF145, y VEGF165 se unen a VEGFR-2; VEGF165 se une a neuropilina-1; y VEGF165 y VEGF145 se unen a neuropilina-2. Véase, por ejemplo, Neufeld y col., FASEB J. 13:9-22, 1999; Stacker y Achen, Growth Factors 17:1-11, 1999; Ortega y col., Fron. Biosci. 4:141-152, 1999; Zachar y , Intl. J. Biochem. Cell Bio. 30:1169-1174, 1998; Petrova y col., Exp. Cell Res. 253:117130, 1999.

La angiogénesis dirigida por VEGF-A tiene un papel principal en la patogénesis de diversas enfermedades humanas, incluyendo cáncer, trastornos oculares, y... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo biespecífico que neutraliza tanto PDGFRβ como VEGF-A, comprendiendo dicho anticuerpo biespecífico:

(I) una primera región de unión a antígeno que se une específicamente al dominio extracelular de PDGFRβ y neutraliza la actividad PDGFRβ, en donde dicha región de unión a PDGFRβ comprende un dominio VL (VL-PDGFR) que comprende las CDR LCDR1PDGFR, LCDR2PDGFR y LCDR3PDGFR y un dominio VH (VH-PDGFR) que comprende las CDR HCDR1PDGFR, HCDR2PDGFR y HCDR3PDGFR, en donde:

LCDR1PDGFR, LCDR2PDGFR y LCDR3PDGFR tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los resto.

2. 40, los resto.

5. 62 y los resto.

9. 103 de la SEC ID Nº 46; y HCDR1PDGFR, HCDR2PDGFR y HCDR3PDGFR tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los resto.

3. 35, los resto.

5. 66, y los resto.

9. 111 de la SEC ID Nº 48; y

(II) una segunda región de unión a antígeno que se une específicamente a VEGF-A y neutraliza la actividad VEGF-A, en donde dicha región de unión a VEGF-A comprende un dominio VL (VL-VEGF) que comprende las CDR LCDR1VEGF, LCDR2VEGF y LCDR3VEGF y un dominio VH (VHVEGF) que comprende las CDR HCDR1VEGF, HCDR2VEGF y HCDR3VEGF, en donde:

LCDR1VEGF, LCDR2VEGF y LCDR3VEGF tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los resto.

2. 34, los resto.

5. 56 y los resto.

8. 97 de la SEC ID Nº 278; y HCDR1VEGF, HCDR2VEGF y HCDR3VEGF tienen las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en los resto.

3. 35, los resto.

5. 66 y los resto.

9. 110 de la SEC ID Nº 280;

en donde dicha primera región de unión a antígeno y dicha segunda región de unión a antígeno muestran, cada una, una afinidad de unión (Ka) de 108 M-1 o mayor.

2. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los dominios VL-PDGFR y VH-PDGFR comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº 46 y 48, respectivamente.

3. El anticuerpo biespecífico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que los dominios VL-VEGF y VH-VEGF comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID Nº 278 y 280, respectivamente.

4. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que VL-PDGFR, UH-PDGFR, VL-VEGF y VH-VEGF comprenden las secuencias de aminoácidos mostradas, respectivamente, en las SEC ID Nº 46, 48, 278 y 280.

5. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, en donde dicho anticuerpo biespecífico opcionalmente comprende una región constante de cadena pesada de inmunoglobulina, tal como un fragmento Fc.

6. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5, en el que el fragmento Fc comprende una región Fc modificada para reducir o eliminar una o más funciones efectoras.

7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 5, en donde dicho anticuerpo es un tascFv, un biscFv o un biAb.

8. El anticuerpo biespecífico de cualquier reivindicación anterior, en donde dicho anticuerpo biespecífico es un bi-Fv de cadena sencilla (biscFv) .

9. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 8, en donde dicho biscFv comprende los restos aminoacídicos 20773 de la SEC ID Nº 628.

10. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquier reivindicación anterior; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

11. Un polinucleótido aislado que codifica un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

12. Un polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el polinucleótido comprende las secuencias de ácido nucleico de las SEC ID Nº 45 y 47.

13. Un polinucleótido aislado de acuerdo con las reivindicaciones 11 ó 12, en donde el polinucleótido comprende las secuencias de ácido nucleico de las SEC ID Nº 277 y 279.

14. Un vector de expresión que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 11-13.

15. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 14.

16. Un procedimiento para producir un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1

9, comprendiendo el procedimiento cultivar la célula huésped de la reivindicación 15 en condiciones en que se exprese el anticuerpo biespecífico; y aislar el anticuerpo biespecífico de la célula huésped.

17. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para su uso como medicamento.

18. Uso de un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno neovascular.

19. Un anticuerpo biespecífico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso en el tratamiento de un trastorno neovascular.

20. Uso de acuerdo con la reivindicación 18, o un anticuerpo biespecífico de la reivindicación 19 para su uso de 10 acuerdo con la reivindicación 19, en el que el trastorno neovascular es:

(a) un cáncer caracterizado por crecimiento de tumores sólidos, tal como un cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer pancreático, carcinoma de células renales (RCC) , cáncer colorrectal, cáncer pulmonar no microcítico (NSCLC) , tumor estromático gastrointestinal (GIST) y glioblastoma; o

(b) un trastorno ocular neovascular, tal como un trastorno ocular neovascular seleccionado entre el grupo que

consiste en degeneración macular relacionada con la edad, retinopatía diabética, neovascularización del iris, glaucoma neovascular y vitrorretinopatía proliferativa.

Fig. 1C