Anticuerpos anti-NKG2A y usos de los mismos.

Anticuerpo que se une específicamente a NKG2A, que comprende residuos de unión a antígeno de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo murino Z270 y secuencias de región de entramado aceptoras humanas,

en el que el dominio VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y el dominio 5 VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.

Anticuerpos anti-NKG2A y usos de los mismos Campo de la invención

La presente invención se refiere a anticuerpos anti-NKG2A, en particular a versiones humanizadas del anticuerpo anti-NKG2A murino Z27, así como a métodos de producción y uso de tales anticuerpos.

Antecedentes de la invención

CD94/NKG2A es un receptor inhibidor de citotoxicidad encontrado en subconjuntos de células NK, NKT y T, que restringe su capacidad de destrucción a células que expresan el ligando de CD94/NKG2A, HLA-E (véase, por ejemplo, el documento W99/28748). Los anticuerpos que inhiben CD94/NKG2A pueden aumentar la actividad citolítica de linfocitos específicos de tumor contra células tumorales. Por tanto, anticuerpos terapéuticos que inhiban CD94/NKG2A en pacientes con cáncer sin destruir células que expresan CD94/NKG2A pueden controlar el crecimiento tumoral. Además, determinados linfomas tales como, por ejemplo, linfomas de células NK, se caracterizan por expresión de CD94/NKG2A. En tales pacientes, anticuerpos terapéuticos que seleccionen como diana y destruyan células que expresan CD94/NKG2A pueden ser capaces de erradicar células tumorales. También se han sugerido anticuerpos anti-NKG2A para su uso en tratar enfermedades autoinmunitarias o inflamatorias (véanse, por ejemplo, los documentos US2395965A1, W267286).

Se han descrito en la técnica diversos anticuerpos contra CD94/NKG2A. Por ejemplo, Sivori et al. (Eur J Immunol 1996;26:2487-92) se refieren al anticuerpo anti-NKG2A murino Z27; Carretero ef al. (Eur J Immunol 1997;27:563-7) describen el anticuerpo anti-NKG2A Z199 (ahora disponible comercialmente a través de Beckman Coulter, Inc., n.2 de producto IM275, EE.UU.); Vanee et al. (J Exp Med 1999;19: 181-12) se refieren al anticuerpo anti-NKG2- murino 2D5 (ahora disponible comercialmente a través de BD Biosciences Pharmingen, n.2 de catálogo 55518, EE.UU.); y la publicación de solicitud de patente estadounidense 2395965 describe el anticuerpo murino 3S9, que se une supuestamente a NKG2A, NKG2C y NKG2E. Y además el documento US25/372 A1 (VELARDI ANDREA ET AL) 17 de febrero de 25 (17-2-2517) menciona el anticuerpo anti-NKG2A murino Z27 y afirma que está disponible de Immunotech, Francia.

El método de injerto de SDR o de CDR abreviado para la humanización de anticuerpos se da a conocer en Gonzales Noreen E. et al (Tumor Biology 25, Vol.: 26, parte 1, páginas: 31-43), que también da a conocer que la posición 59-65 de CDR-H2 puede sustituirse por homólogos humanos y que es posible la manipulación adicional de la región de entramado para minimizar el potencial inmunogénico del anticuerpo humanizado. Kashmiri et al. (Methods 25, Vol.: 36, parte: 1, páginas 25-34) da a conocer adicionalmente un enfoque general para la humanización de anticuerpos mediante injerto de SDR y de CDR abreviado.

Los anticuerpos anti-CD94/NKG2A disponibles actualmente no son de origen humano, lo que los hace inadecuados para la mayoría de las aplicaciones terapéuticas en seres humanos debido a su inmunogenicidad. Aunque se dispone de enfoques de humanización sencillos tales como, por ejemplo, injerto de CDR, normalmente se necesitan enfoques de humanización individualizados para obtener una variante humanizada óptima, minimizando la inmunogenicidad mientras que se conservan suficientemente o se mejoran las propiedades funcionales. Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos anti-CD94/NKG2A que sean adecuados para el tratamiento de pacientes humanos.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un anticuerpo anti-NKG2A tal como se define en las reivindicaciones, así como composiciones que comprenden ese anticuerpo, y métodos de producción y uso de dicho anticuerpo. Este anticuerpo es una versión humanizada del anticuerpo anti-NKG2A murino Z27, designado en el presente documento humZ27.

Se proporcionan residuos de región determinante de complementariedad (CDR) y/o sitios para sustituciones de aminoácidos en la región de entramado (FR) y/o de tales anticuerpos para producir anticuerpos que tienen propiedades mejoradas tales como, por ejemplo, inmunogenicidad inferior, unión a antígeno mejorada u otras propiedades funcionales, y/o propiedades fisicoquímicas mejoradas tales como, por ejemplo, mejor estabilidad.

En otros aspectos, la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden tal anticuerpo y un portador, e inmunoconjugados que comprende tal anticuerpo conjugado con un agente citotóxico o detectable.

En otros aspectos, la invención proporciona ácidos nucleicos y vectores que codifican para tal anticuerpo, y células huésped que contienen tales ácidos nucleicos y/o vectores. También se proporcionan métodos recombinantes de producir anticuerpos anti-NKG2A cultivando tales células huésped de modo que se produzcan los ácidos nucleicos.

En otros aspectos, la invención proporciona artículos de fabricación que comprenden un recipiente que comprende dicho anticuerpo anti-NKG2A e instrucciones que dirigen a un usuario en el tratamiento de un trastorno tal como cáncer o una enfermedad viral en un paciente. Opcionalmente, el artículo puede comprender otro recipiente que contiene otro agente, en el que las instrucciones dirigen al usuario en el tratamiento del trastorno con el anticuerpo en combinación con el agente.

La invención también proporciona métodos de uso de tal anticuerpo anti-NKG2A en el tratamiento de trastornos tales como cáncer, una enfermedad viral, un trastorno inflamatorio o un trastorno autoinmunitario en un paciente, de manera opcional conjuntamente con otro agente anticancerígeno, anti-enfermedad viral o agente antiinflamatorio.

Descripción de los dibujos

La figura 1 muestra una alineación de Z27VL y Z27VH con segmentos V y J de línea germinal seleccionados y las secuencias a modo de ejemplo humZ27VL1 (SEQ ID NO: 4) y humZ27VH1 (SEQ ID NO: 5), numerándose los residuos de aminoácido según el esquema de Kabat (Kabat et al, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.) Los residuos de enmascaramiento están sombreados en el esquema de Kabat; los residuos de CDR se muestran en negrita en el esquema de Kabat; las diferencias ratón/línea germinal están sombreadas en las secuencias de VKI_2/JK4 (SEQ ID NO: 9) y VH1_18/JH6 (SEQ ID NO: 1); y los posibles residuos de retromutación están sombreados en las secuencias de humZ27VH/VL. Las posibles retromutaciones identificadas en VL fueron L46F y I48V. Las posibles retromutaciones identificadas en la cadena pesada fueron V5Q, M69L, T71V, T73K y T75S. También se muestran las secuencias consenso resultantes de humZ27VL (humZ27VL1 cons; SEQ ID NO: 6) y humZ27VH1 (humZ27VH1 cons; SEQ ID NO: 7). En humZ27VL1 cons, el aminoácido en la posición 46 es L o F, y el aminoácido en la posición 48 es I o V. En humZ27VH1 cons, el aminoácido en la posición 5 es V o Q; el

aminoácido en la posición 69 es M o L; el aminoácido en la posición 71 es T o V; el aminoácido en la posición 73 es

T o K; y/o el aminoácido en la posición 75 es T o S. En una humZ27VH1 alternativa, humZ27VH1cons2 (SEQ ID NO: 8), el aminoácido en la posición 5 es V o Q; el aminoácido en la posición 6 es S o A; el aminoácido en la posición 63 es L o F; el aminoácido en la posición 64 es Q o K; el aminoácido en la posición 65 es G o D; el

aminoácido en la posición 66 es R o K; el aminoácido en la posición 67 es V o A; el aminoácido en la posición 69 es

M o L; el aminoácido en la posición 71 es T o V; el aminoácido en la posición 73 es T o K; y/o el aminoácido en la posición 75 es T o S.

La figura 2 muestra las CDR de un anticuerpo humZ27 a modo de ejemplo, según las definiciones de Kabat. Las diferencias comparadas con CDR de Z27 murino se muestran en negrita.

Las figuras 3A-H muestran plásmidos a los que se hace referencia en los ejemplos. (A) Mapa de vector pMD19-T para clonación TA. (B) Mapa de vector de clonación pJSV2 para expresión transitoria. (C) La cadena ligera se inserta en pJSV2 con la región constante kappa murina. (D) Variante pJSV2-mlgG1 que contiene la región constante de lgG1 murina. (E) pJSV2-mlgG1 Z27 H1 que contiene la región variable de cadena pesada de Z27 y la región constante de cadena pesada de lgG1. (F) pJSV2-hKappa Z27 L11 que contiene la región variable de cadena ligera y la región constante de cadena kappa humana. (G) pJSV2-lgG4-S241 P. (H) pJSV2-lgG4-S241 P Z27H1.

La figura 4 muestra diferentes secuencias derivadas de o basadas en Z27, de (A) a (J), SEQ ID NOS: 14-23, respectivamente. Véanse los ejemplos 2-5 para más detalles.

La figura 5 muestra un diseño a modo de ejemplo de un vector para la expresión de cadenas... [Seguir leyendo]

1. Anticuerpo que se une específicamente a NKG2A, que comprende residuos de unión a antígeno de las regiones determinantes de complementariedad (CDR) del anticuerpo murino Z27 y secuencias de región de entramado

aceptoras humanas, en el que el dominio VH comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5 y el dominio VL comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.

2. Anticuerpo según la reivindicación 1, que es más eficaz que un anticuerpo que comprende las secuencias variables ligera (VL) (SEQ ID NO: 1) y VH (SEQ ID NO: 2) del anticuerpo murino Z27 en potenciar la actividad

citotóxica de un linfocito citotóxico que expresa CD94/NKG2A.

3. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un anticuerpo lgG4.

4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un fragmento de anticuerpo o un 15 anticuerpo multiespecífico.

5. Método para producir un anticuerpo anti-NKG2A, que comprende cultivar una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica para el anticuerpo anti-NKG2A según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 de modo que se expresa el ácido nucleico y se produce el anticuerpo.

6. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 y un portador farmacéuticamente aceptable.

7. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o composición farmacéutica según la reivindicación 8, 25 para su uso en el tratamiento de un paciente humano que padece un trastorno seleccionado de un cáncer, una

enfermedad viral, un trastorno inflamatorio y un trastorno autoinmunitario.