Anticuerpos anti-EphB4 y métodos para usar los mismos.

Un anticuerpo anti-EphB4 aislado que comprende seis HVR, en el que cada HVR comprende o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 1-17,

y en el que las SEC ID Nº 9 o corresponden a una HVR-L1, las SEC ID Nº 11 o 12 correspondeb a una HVR-L2, las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16 o 17 corresponden a una HVR-L3, las SEC ID Nº 1 o 2 corresponden a una HVR-H1, las SEC ID Nº 3, 4, 5 o 6 corresponden a una HVR-H2, y las SEC ID Nº 7 u 8 corresponden a una HVR-H3, en donde el anticuerpo bloquea la unión de efrinaB2 a EphB4 y bloquea la fosforilación de tirosina mediada por efrinaB2 de EphB4 y no reacciona de forma cruzada con EphB1 humano, EphB2 humano, EphB3 humano o EphB6 humano.

Anticuerpos anti-EphB4 y métodos para usar los mismos Campo de la invención La presente invención se refiere en líneas generales a los campos de biología molecular. Más específicamente, la invención se refiere a anticuerpos anti-EphB4, y a usos de los mismos.

Antecedentes de la invención El desarrollo de un suministro vascular es un requisito fundamental para muchos procesos fisiológicos y patológicos. Los tejidos de crecimiento activo tales como embriones y tumores requieren un suministro adecuado de sangre. Satisfacen esta necesidad produciendo factores pro-angiogénicos, que promueven la formación de nuevos vasos sanguíneos mediante un proceso llamado angiogénesis. La formación de conductos vasculares es un acontecimiento biológico complejo pero ordenado que implica todas o muchas de las siguientes etapas: a) las células endoteliales (EC) proliferan a partir de EC existentes o se diferencian a partir de células progenitoras; b) las EC migran y se unen para formar estructuras tipo cordón; c) los cordones vasculares después experimentan tubulogénesis para formar vasos con un lumen central; d) los cordones o vasos existentes emiten brotes para formar vasos secundarios; e) el plexo vascular primitivo experimenta remodelado reformación adicional; y f) se reclutan células peri-endoteliales para revestir los conductos endoteliales, proporcionando funciones de mantenimiento y modulación a los vasos; incluyendo dichas células pericitos para capilares pequeños, células de músculo liso para vasos grandes, y células de miocardio en el corazón. Hanahan, Science 277:48-50 (1997) ; Hogan y Kolodziej, Nat. Rev. Genet. 3:513-23 (2002) ; Lubarsky y Krasnow, Cell 112:19-28 (2003) .

Ahora está bien establecido que la angiogénesis está implicada en la patogénesis de diversos trastornos. Éstos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis, fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades neovasculares intraoculares tales como retinopatías proliferativas, por ejemplo, retinopatía diabética, degeneración macular relacionada con la edad (AMD) , glaucoma neovascular, rechazo inmune de tejido corneal transplantado y otros tejidos, artritis reumatoide, y psoriasis. Folkman et al., J. Biol. Chem. 267:10931-34 (1992) ; Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol. 53:217-39 (1991) ; y Garner A., "Vascular diseases, " En: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2ª Edición (Marcel Dekker, NY, 1994) , pág. 16251710.

En el caso de crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser crucial para la transición de hiperplasia a neoplasia, y para proporcionar nutrición para el crecimiento y metástasis del tumor. Folkman et al., Nature 339:58 (1989) . La neovascularización permite que las células tumorales adquieran ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. Un tumor habitualmente comienza como una única célula aberrante que puede proliferar solamente hasta un tamaño de unos pocos milímetros cúbicos debido a la distancia desde los lechos capilares disponibles, y puede permanecer 'latente' sin crecimiento adicional y diseminación durante un largo periodo de tiempo. Algunas células tumorales cambian al fenotipo angiogénico para activar células endoteliales, que proliferan y maduran en nuevos vasos sanguíneos capilares. Estos vasos sanguíneos recién formados no solamente facilitan el crecimiento continuado del tumor primario, sino también la diseminación y recolonización de células tumorales matastásicas. Por consiguiente, se ha observado una correlación entre la densidad de microvasos en secciones tumorales y la supervivencia del paciente en cáncer de mama así como en otros varios tumores. Weidner et al., N. Engl. J. Med. 324:1-6 (1991) ; Horak et al. Lancet 340:1120-24 (1992) ; Macchiarini et al. Lancet 340:145-46 (1992) . Los mecanismos precisos que controlan el cambio angiogénico no está bien comprendido, pero se cree que la neovascularización de la masa tumoral resultan del balance neto de una multitud de estimuladores e inhibidores de la angiogénesis (Folkman, Nat. Med. 1 (1) :27-31 (1995) ) .

El proceso de desarrollo vascular está firmemente regulado. Hasta le fecha, una cantidad significativa de moléculas, principalmente factores secretados producidos por células adyacentes, ha demostrado regular la diferenciación, proliferación, migración y unión de EC en estructuras tipo cordón. Por ejemplo, el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) se ha identificado como el factor clave implicado en la estimulación de la angiogénesis y en la inducción de la permeabilidad vascular. Ferrara et al., Endocr. Rev. 18:4-25 (1997) . El hallazgo de que la pérdida de incluso un único alelo de VEGF provoca letalidad embrionaria apunta hacia un papel irremplazable desempeñado por este factor en el desarrollo y diferenciación del sistema vascular. Además, VEGF ha demostrado ser un mediator clave de la neovascularización asociada con tumores y trastornos intraoculares. Ferrara et al., Endocr. Rev. supra. El ARNm de VEGF se sobre-expresa por la mayoría de los tumores humanos examinados. Berkman et al., J. Clin. Invest. 91:153-59 (1993) ; Brown et al., Human Pathol. 26:86-91 (1995) ; Brown et al., Cancer Res. 53:4727-35 (1993) ; Mattern et al., Brit. J. Cancer 73:931-34 (1996) ; Dvorak et al., Am. J. Pathol. 146:1029-39 (1995) .

Además, los niveles de concentración de VEGF en fluidos oculares están altamente correlacionados con la presencia de proliferación activa de vasos sanguíneos en pacientes con retinopatías diabéticas y otras retinopatías relacionadas con isquemia. Aiello et al., N. Engl. J. Med. 331:1480-87 (1994) . Además, algunos estudios han demostrado la localización de VEGF en membranas neovasculares coroidales en pacientes afectados por AMD.

Lopez et al., Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. 37:855-68 (1996) .

Los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF suprimen el crecimiento de diversas líneas celulares de tumor humano en ratones desnudos (Kim et al., Nature 362:841-44 (1993) ; Warren et al., J. Clin. Invest. 95:1789-97 (1995) ; Borgström et al., Cancer Res. 56:4032-39 (1996) ; Melnyk et al., Cancer Res. 56:921-24 (1996) ) y también inhiben la angiogénesis intraocular en modelos de trastornos isquémicos de retina (Adamis et al., Arch. Ophtalmol. 114:66-71 (1996) ) . Por lo tanto, los anticuerpos monoclonales anti-VEGF u otros inhibidores de la acción de VEGF son candidatos prometedores para el tratamiento de tumores y diversos trastornos neovasculares intraoculares. Dichos anticuerpos se describen, por ejemplo, en el documento EP 817.648, publicado el 14 de enero de 1998; y en el documento WO 98/45331 y el documento WO 98/45332, ambos publicados el 15 de octubre de 1998. Un anticuerpo anti-VEGF, bevacizumab, se ha aprobado por la FDA para su uso en combinación con un régimen de quimioterapia para tratar cáncer colorrectal metastásico (CRC) . Y bevacizumab se está investigando en muchos ensayos clínicos en curso para tratar diversas indicaciones cancerosas.

El receptor EphB4 ("EphB4" o "EphB4R") es un miembro de la familia de receptores eph, que constituye la familia más grande de receptores tirosina quinasa en el genoma humano (revisado en Dodelet, Oncogene, 19: 5614-5619, 2000) . Las tirosina quinasas de receptores eph humanos se clasifican por identidad de secuencia en una clase A y una clase B con correspondientes ligandos de tipo A y tipo B mencionados como efrinas. La señalización puede suceder de manera directa, en que el receptor tirosina quinasa se activa por el ligando, y de manera inversa, en que los ligandos efrinaB transmembrana se activan mediante la interacción con receptores. Las interacciones del ligando del receptor Eph se han implicado en una amplia gama de funciones biológicas incluyendo guía de axones, formación de límites tisulares, vasculogénesis, y motilidad celular (Kullander et al. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol., 3: 475486, 2002; Cheng et al. Cytokine Growth Factor Rev., 13: 75-85, 2002; Coulthard et al. Int. J. Dev. Biol., 46: 375384, 2002) . EphB4 se une a ligandos tales como efrina-B1, efrina-B2, y efrina-B3. El receptor EphB4 tiene una región extracelular con un motivo rico en cisteínas que se extiende sobre su mitad amino-terminal seguida de dos motivos de fibronectina tipo II. Existe un dominio intracelular que presenta una región quinasa conservada y un dominio transmembrana.

Está claro que sigue existiendo la necesidad de agentes que tengan atributos clínicos que sean óptimos para su desarrollo como agentes terapéuticos. La invención descrita en este documento cumple esta necesidad y proporciona otros beneficios.

El documento WO 2004/024773 describe métodos para inhibir el crecimiento canceroso de una célula... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo anti-EphB4 aislado que comprende seis HVR, en el que cada HVR comprende o consiste en una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las SEC ID Nº 1-17, y en el que las SEC ID Nº 9 o 10 corresponden a una HVR-L1, las SEC ID Nº 11 o 12 correspondeb a una HVR-L2, las SEC ID Nº 13, 14, 15, 16 o 17 corresponden a una HVR-L3, las SEC ID Nº 1 o 2 corresponden a una HVR-H1, las SEC ID Nº 3, 4, 5 o 6 corresponden a una HVR-H2, y las SEC ID Nº 7 u 8 corresponden a una HVR-H3, en donde el anticuerpo bloquea la unión de efrinaB2 a EphB4 y bloquea la fosforilación de tirosina mediada por efrinaB2 de EphB4 y no reacciona de forma cruzada con EphB1 humano, EphB2 humano, EphB3 humano o EphB6 humano.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo comprende HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 y HVR-H3, en donde cada una, en orden, comprende:

(i) las SEC ID Nº 9, 11, 13, 1, 3 y 7;

(ii) las SEC ID Nº 10, 12, 14, 1, 3 y 8;

(iii) las SECID Nº 9, 11, 15, 2, 4 y 7;

(iv) las SEC ID Nº 9, 11, 16, 1, 5 y 7; o

(v) las SEC ID Nº 9, 11, 17, 1, 6 y 7.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo comprende la secuencia flanqueante consenso de cadena pesada humana de subgrupo III y comprende una sustitución en una o más de las posiciones 71, 73 o 78, opcionalmente una o más de R71A, N73T o N78A.

4. Un polinucleótido que codifica un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 4, opcionalmente en donde el vector es un vector de expresión.

6. Una célula hospedadora que comprende un vector de la reivindicación 5, opcionalmente en donde la célula hospedadora es de mamífero.

7. Un método in vitro para preparar un anticuerpo anti-EphB4 o un inmunoconjugado anti-EphB4, comprendiendo dicho método (a) expresar un vector de expresión de la reivindicación 5 en una célula hospedadora adecuada, y (b) recuperar el anticuerpo.

8. Un método para la detección de EphB4, comprendiendo el método detectar complejo EphB4-anticuerpo anti-EphB4 en una muestra biológica, en donde el anticuerpo anti-EphB4 en el complejo es un anticuerpo anti-EphB4 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente en donde el anticuerpo anti-EphB4 está marcado de forma detectable.

9. Un método para diagnostica un tumor, un cáncer y/o un trastorno proliferativo celular asociados con expresión de EphB4, comprendiendo el método detectar complejo EphB4-anticuerpo anti-EphB4 en una muestra biológica de un paciente que tiene o se sospecha que tiene el trastorno, en donde el anticuerpo anti-EphB4 en el complejo es un anticuerpo anti-EphB4 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, opcionalmente en donde el anticuerpo anti-EphB4 está marcado de forma detectable.

10. Una composición que comprende un anticuerpo anti-EphB4 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 o un polinucleótido o un vector de las reivindicaciones 4 o 5, opcionalmente en donde la composición comprende adicionalmente un vehículo.

11. El anticuerpo anti-EphB4 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en un método de tratamiento médico.

12. El anticuerpo anti-EphB4 para el uso de la reivindicación 11, que es para su uso en un método para inhibir la angiogénesis, comprendiendo el método la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo a un sujeto que necesite dicho tratamiento, comprendiendo adicionalmente el método opcionalmente administrar al sujeto una cantidad eficaz de un agente anti-angiogénico, en donde el agente anti-angiogénico es opcionalmente un antagonista del factor de crecimiento celular del endotelio vascular (VEGF) , opcionalmente además un anticuerpo anti-VEGF, opcionalmente además también bevacizumab.

13. El anticuerpo anti-EphB4 para el uso de la reivindicación 12, comprendiendo adicionalmente el método administrar una cantidad eficaz de un agente quimioterapéutico.

14. El anticuerpo anti-EphB4 para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 11-13, que es para su uso en un método para tratar un cáncer, un tumor y/o un trastorno proliferativo celular, comprendiendo el método la administración de una cantidad eficaz del anticuerpo a un sujeto que necesite dicho tratamiento.

15. Uso de un anticuerpo anti-EphB4 de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la preparación de un medicamento para inhibir la angiogénesis y/o tratar un cáncer, un tumor, y/o un trastorno proliferativo celular.