Anticuerpos alfa 5-beta 1 y sus usos.

Un anticuerpo monoclonal aislado capaz de unirse a la integrina α

5ß1 que comprende:

(a) una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 1;

(b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 2;

(c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 3;

(d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4;

(e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 5; y

(f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 6.

Anticuerpos alfa 5-beta 1 y sus usos Campo de la invención La presente descripción se refiere a anticuerpos y partes de unión al antígeno de los mismos que se unen a α5β1. La descripción también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican dichos anticuerpos y partes de unión al antígeno, a métodos para hacer anticuerpos contra α5β1 y partes de unión al antígeno, a composiciones que comprenden estos anticuerpos y partes de unión al antígeno y a métodos de uso de los anticuerpos, partes de unión al antígeno y composiciones.

Antecedentes La integrina α5β1 es una proteína de superficie celular heterodímera que se une a la fibronectina y está implicada en la unión celular y angiogénesis. Este heterodímero está compuesto de una subunidad α5 y una subunidad β1. La integrina α5β1 se denomina el “receptor de fibronectina clásico” y tiene funciones principales en la adhesión a la matriz, migración, proliferación, diferenciación y supervivencia. Aunque varias integrinas se unen a la fibronectina (FN) , la α5β1 es selectiva para la FN ya que requiere tanto las secuencias peptídicas de las repeticiones novena (PHSRN) como décima (RGDS) de tipo 3 de la FN para el reconocimiento de ligando y la interacción óptima. (Danen et al. J. Biol. Chem. 270 (37) :21612-21618 (1995) ; Redick et al. J. Cell Biol. 149 (2) :521-527 (2000) ; Takagi et al. EMBO J. 22:4607-4615 (2003) ) . La adhesión celular mediada por integrina a la FN puede producir flujos de calcio, activar tirosina y serina/treonina proteína quinasas y el metabolismo de lípidos por inositol, y regula la actividad de la familia Rho de las GTPasas pequeñas que controla el citoesqueleto de actina y desarrollo del ciclo celular.

La expresión de la α5β1se observa en la mayoría de los tejidos embrionarios, pero el nivel disminuye después del nacimiento de una forma acorde con la diferenciación celular terminal (Muschler & Horwitz Development 113 (1) :327337 (1991) ) . En ratones adultos genéticamente intactos, la expresión es principalmente en la vasculatura y el tejido conjuntivo, aunque el receptor está ampliamente distribuido en niveles bajos. La expresión tanto de α5β1 como de la FN son potenciadas de forma significativa y coordinada en los vasos sanguíneos en tumores humanos y en tejidos estimulados por citoquinas y factores de crecimiento. Las citoquinas angiogénicas tales como bFGF, VEGF, IL-8, TGF-beta, y TNF-α favorecen la expresión de α5β1 en células endoteliales in vitro e in vivo, mientras que estas moléculas son expresadas mínimamente en vasos y tejidos humanos normales (Kim et al. Am. J. Path. 156 (4) : 1345-62 (2000) ; Enaida et al. Fukushima J. Med. Sci 44 (l) :43-52 (1998) ; Klein et al. Mol. Biol. Cell 4 (10) :973-982 (1993) ) .

Los niveles altos de expresión de α5β1 no están limitados a la vasculatura, ya que también se observa con frecuencia que las células tumorales expresan α5β1 en muchos tipos de cáncer. La hipoxia tumoral se ha asociado con la expresión tumoral aumentada de α5β1 (Mousa et al. J. Cell. Biochem. 74:135-143 (1999) ) . Se cree que las integrinas son importantes para la intravasación tumoral en capilares recién formados y la extravasación a sitios distantes, conduciendo a la extensión tumoral y enfermedad metastásica. En conjunto, el patrón de expresión de α5β1 está de acuerdo con muchas funciones en la promoción del cáncer, mediando las actividades tanto de las células estromales como tumorales. Varios estudios clínicos han asociado la regulación por aumento de α5β1 en las células tumorales con el avance del melanoma humano, carcinoma de células escamosas orales, y leucemias de linfocitos B (Jin & Varner, Br. J. Cancer 90:561-565 (2004) ; Danen et al. Histopathology 24 (3) :249-256 (1994) ; Shinohara et al., Am. J. Clin. Pathol. 111 (1) :75-88 (1999) ) .

Resumen La presente descripción proporciona anticuerpos monoclonales humanos aislados que presentan una alta afinidad de unión a la integrina α5β1 humana.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado capaz de unirse a la integrina α5β1, que comprende: (a) una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 1; (b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 2; (c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 3; (d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4; (e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 5; y

(f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 6. Por ejemplo, el anticuerpo pertenece a una subclase que es capaz de inducir la ADCC, tal como la IgG1 o IgG3. La actividad de ADCC es el resultado de introducir modificaciones de hidratos de carbono, tal como patrones de glicosilación alterados, en la región Fc comparada con el patrón de hidratos de carbono natural.

En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada y ligera de los anticuerpos.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico.

En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula hospedante que comprende el vector de expresión.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-α5β1 que comprende expresar el anticuerpo en la célula hospedante.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona el anticuerpo, o la composición para usar en la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan la integrina α5β1.

En algunos casos, el anticuerpo se une a la integrina α5β1 humana con una KD de 5 x 10-8 M o menor, 2 x 10-8 M o menor, 1 x 10-8 M o menor, 5 x 10-9 M o menor, 4 x 10-9 M o menor, 3 x 10-9 M o menor, o 2, 7 x 10-9 M o menor.

El anticuerpo de la invención presenta una actividad de ADCC debida a al menos una mutación en la región Fc comparada con la región Fc natural, y la actividad de ADCC potenciada es respecto al mismo anticuerpo anticuerpo, pero que comprende la región Fc natural. El anticuerpo de la invención se une a la integrina α5β1 humana con una KD de 5 x 10-8 M o menor, 2 x 10-8 M o menor, 1 x 10-8 M o menor, 5 x 10-9 M o menor, 4 x 10-9 M o menor, 3 x 10-9 M

o menor, o 2, 7 x 10-9 M o menor. En ejemplos adicionales, el anticuerpo demuestra una actividad de ADCC potenciada con respecto a un anticuerpo comparable que es al menos 1, 1 veces, al menos 1, 2 veces, al menos 1, 3 veces, al menos 1, 5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 30 veces, al menos 40 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces, o al menos 1000-veces comparada con un anticuerpo comparable, en donde el anticuerpo comparable es el mismo anticuerpo, pero con la región Fc natural.

El anticuerpo de la invención puede pertenecer a la subclase IgG1 y al menos un aminoácido en la región Fc de la subclase IgG1 está mutado. En un ejemplo adicional, la al menos una mutación ocurre en la posición de la serina 247, alanina 338 o isoleucina 340 en la región Fc de la subclase IgG1. En un ejemplo adicional, la al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en S247D, A338L y I340E. En un ejemplo adicional más, el anticuerpo comprende las mutaciones S247D, A338L y I340E.

El anticuerpo de la invención compite de forma cruzada o compite por la unión a la integrina α5β1 humana con un anticuerpo que comprende: (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, o modificaciones conservativas de la misma; y (b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8, o modificaciones conservativas de la misma.

En una realización, la descripción proporciona el material depositado en la ATCC como depósito nº PTA-9377. En otra realización, la descripción proporciona el material depositado en la ATCC como depósito nº PTA-9378. En otra realización, la descripción proporciona un anticuerpo aislado que comprende la región variable de la cadena pesada como está depositada en la ATCC como depósito nº PTA-9377. En otra realización, la descripción proporciona... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo monoclonal aislado capaz de unirse a la integrina α5ß1 que comprende:

(a) una región variable de la cadena pesada CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 1;

(b) una región variable de la cadena pesada CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 2; 5 (c) una región variable de la cadena pesada CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 3;

(d) una región variable de la cadena ligera CDR1 que comprende la SEQ ID NO: 4;

(e) una región variable de la cadena ligera CDR2 que comprende la SEQ ID NO: 5; y

(f) una región variable de la cadena ligera CDR3 que comprende la SEQ ID NO: 6.

2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende 10 (a) una región variable de la cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y

(b) una región variable de la cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.

3. El anticuerpo de la reivindicación 1 o reivindicación 2, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo IgG1 humano de longitud completa, y en donde al menos un aminoácido en la región Fc de dicho anticuerpo está mutado, y además en donde dicho anticuerpo presenta mayor ADCC que un anticuerpo idéntico en donde dicho al menos un aminoácido no está mutado.

4. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde la al menos una mutación se produce en la posición del aminoácido serina 247, alanina 338 o isoleucina 340.

5. El anticuerpo de la reivindicación 3, en donde la al menos una mutación se selecciona del grupo que consiste en de serina 247 a ácido aspártico (S247D) , de alanina 338 a leucina (A338L) , y de isoleucina 340 a ácido glutámico

(I340E) .

6. El anticuerpo de la reivindicación 5, donde el anticuerpo comprende las mutaciones S247D, A338L, y I340E.

7. Una composición que comprende el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

8. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada y ligera de los anticuerpos de cualquiera 25 de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 8.

10. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión de la reivindicación 9.

11. Un método para preparar un anticuerpo anti-α5β1 que comprende expresar el anticuerpo en la célula hospedante de la reivindicación 10.

12. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, o la composición de la reivindicación 7 para usar en la inhibición del crecimiento de células tumorales que expresan la integrina α5ß1.