Análogos de oligonucleótidos de biciclonucleósidos.

Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos,

en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (I)

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4,4'-dimetoxitritilo (DMTr), un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita .

Análogos de oligonucleótidos de biciclonucleósidos

Campo técnico Esta invención se refiere a un nuevo análogo de nucleósidos y un nuevo análogo de nucleótidos y, más particularmente, a un análogo de nucleótidos como molécula antisentido. 5

Fundamento técnico

En 1978 se describió por primera vez que una molécula antisentido inhibía la infección por el virus de la gripe. Desde entonces, se han publicado trabajos acerca de moléculas antisentido que inhibían la expresión de oncogenes y la infección de SIDA. En los últimos años, los oligonucleótidos antisentido se han convertido en uno de los fármacos más prometedores, porque controlan específicamente la expresión de genes indeseables. 10

El método antisentido se basa en la idea de controlar un flujo unidireccional denominado el dogma central, es decir, DNA â RNA â proteína, mediante el uso de un oligonucleótido antisentido.

Sin embargo, cuando se aplicaba a este método como molécula antisentido un oligonucleótido existente en la naturaleza, se descomponía con varias nucleasas in vivo, o no era elevada su permeación a través de la membrana celular. Para resolver estos problemas, se han sintetizado numerosos derivados y análogos de ácidos nucleicos, y 15 se ha procedido a su estudio. Ejemplos de los productos sintetizados incluyen un fosforotioato que tiene un átomo de oxígeno sustituido por un átomo de azufre en el átomo de fósforo, y un metil-fosfonato que tiene un grupo metilo sustituyente. Recientemente, se han sintetizado productos en los que el átomo de fósforo se ha sustituido también por un átomo de carbono, o se ha cambiado la estructura del resto azúcar o se ha modificado la base del ácido nucleico. Sin embargo, ningún derivado o análogo resultante ha resultado totalmente satisfactorio en términos de 20 estabilidad in vivo, facilidad de síntesis y especificidad de secuencias (la propiedad de controlar selectivamente la expresión de un gen particular solo) .

Obika et al., ("Properties of Novel Oligonucleotide Analogues Containing an Acyclic Nucleoside and a Carbamate Linkage", Bioorganic & Medicinal Chemistr y Letters, 6 (12) (1996) pp.1357-1360) , describe heterodímeros que contienen un nucleósido acíclico y un enlace de carbamato en posición 3â? incorporado en oligonucleótidos. Se 25 estudiaron las temperaturas de fusión de los dúplex DNA-DNA y DNA-RNA, así como la resistencia a las nucleasas de los oligonucleótidos modificados.

En estas circunstancias, ha existido una demanda para la creación de una molécula antisentido que sea descompuesta mínimamente con una nucleasa in vivo, se una al RNA mensajero diana con elevada afinidad, tenga elevada especificidad y pueda controlar así eficazmente la expresión de un gen particular. 30

Descripción de la invención

Los inventores de la presente invención diseñaron un análogo de ácido nucleico con conformación inmovilizada de la porción de azúcar en un ácido nucleico, que sería útil en el método antisentido. Sintetizaron un análogo de nucleósidos que sería una estructura unitaria para el mismo, y confirmaron que el análogo de oligonucleótidos preparado usándolo era muy útil como molécula antisentido. 35

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un gráfico que muestra la evolución con el tiempo de la absorción ultravioleta (260 nm) de un oligonucleótido natural descompuesto con una exonucleasa; y La Fig. 2 es un gráfico que muestra la evolución con el tiempo de la absorción ultravioleta (260 nm) de un oligonucleótido de la presente invención (X2) descompuesto con una exonucleasa. 40

A continuación se describirán detalles de la presente invención.

La estructura de un análogo de nucleósidos para uso según la presente invención es un análogo de nucleósidos de la siguiente fórmula general (I)

en la que B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o diferentes, y representan cada uno un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo, un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, 5

o uno de sus derivados de amidita.

El grupo alquilo representa un grupo alquilo de cadena lineal o de cadena ramificada con 1 a 20 átomos de carbono. Sus ejemplos incluyen metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, t-butilo, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo y decilo.

El grupo alquenilo representa un grupo alquenilo de cadena lineal o de cadena ramificada con 2 a 20 átomos de 10 carbono. Sus ejemplos incluyen vinilo, alilo, butenilo, pentenilo, geranilo y farnesilo.

El grupo alquinilo representa un grupo alquinilo de cadena lineal o de cadena ramificada con 2 a 20 átomos de carbono. Sus ejemplos incluyen etinilo, propinilo y butinilo.

El grupo cicloalquilo representa un grupo cicloalquilo con 3 a 8 átomos de carbono e incluye, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo. Otro ejemplo es un grupo heterocíclico en el 15 que uno o más grupos metileno arbitrarios en el anillo del grupo cicloalquilo se han sustituido por un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un átomo de nitrógeno sustituido con alquilo. Es, por ejemplo, un grupo tetrahidropiranilo.

El grupo arilo se refiere a un sustituyente monovalente formado eliminando un átomo de hidrógeno de un grupo hidrocarbonado aromático e incluye, por ejemplo, fenilo, tolilo, xililo, bifenilo, naftilo, antrilo y fenantrilo. El átomo de 20 carbono en el anillo del grupo arilo puede estar sustituido por uno o más entre un átomo de halógeno, un grupo alquilo inferior, un grupo hidroxilo, un grupo alcoxilo, un grupo amino, un grupo nitro y un grupo trifluorometilo. El sustituyente, en este caso, es, por ejemplo, un átomo de halógeno, un grupo hidroxilo, un grupo amino, un grupo alcoxi o un grupo ariloxi.

El grupo amino no necesita estar sustituido, pero cuando está sustituido incluye, por ejemplo, alquilamino, arilamino 25 y acilamino. Ejemplos del grupo alcoxi son metoxi, etoxi, n-propoxi, i-propoxi, n-butoxi, i-butoxi, s-butoxi, t-butoxi, pentiloxi, hexiloxi y fenoxi. Ejemplos del átomo de halógeno son flúor, cloro, bromo y yodo.

El grupo aralquilo se selecciona de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) . Se prefiere particularmente un grupo DMTr.

Como grupo acilo, se pueden ilustrar acetilo, formilo, propionilo, benzoílo y benciloxicarbonilo. Un ejemplo del grupo sililo es un grupo trialquilsililo, preferiblemente trimetilsililo, trietilsililo, triisopropilsililo, t-butildimetilsililo o t-30 butildifenilsililo y, más preferiblemente, trimetilsililo.

El análogo de nucleótidos de la presente invención es un análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos que tiene una o más estructuras de la fórmula general (Ia) .

en la que B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, 35

o un análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de la fórmula general (II)

en la que B1 y B son idénticos o diferentes y, cada uno representa una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, R es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un átomo de halógeno o un grupo alcoxi, W1 y W2 son idénticos o diferentes y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo 5 alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo, un grupo arilo, un grupo acilo, un grupo sililo, un residuo de ácido fosfórico, un nucleósido natural o un nucleósido sintético unido por un enlace fosfodiéster o un oligonucleótido o polinucleótido que contiene el nucleósido, los n1 o los n2 son idénticos o diferentes, y cada uno representa un número entero de 0 a 50, con la condición de que los n1 o n2 no sean cero al mismo tiempo y que no todos los n2 sean cero al mismo tiempo, n3 representa un 10 número entero de 1 a 50, con la condición de que cuando n1 y/o n2 son o es 2 o más, B1 y B no necesitan ser idénticos, y los R no necesitan ser idénticos.

La base pirimidínica o purínica de ácido nucleico en la presente invención se refiere a timina, uracilo, citosina, adenina, guanina o uno de sus derivados.

El análogo de nucleósidos y el análogo de nucleótidos de la presente invención se pueden sintetizar del modo 15 descrito a continuación.

(1) Síntesis de análogo de nucleósidos

MeOH (cuant.) Piridina (59%) PiridinaDMAP (66%)

El compuesto 1, sintetizado a partir de uridina de acuerdo con la bibliografía [1) J.A. Secrist et al., J. Am. Chem. Soc., 101,... [Seguir leyendo]

1. Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos, en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (I)

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o 5 diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita.

2. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico del análogo de nucleósidos se selecciona de timina, uracilo, citosina, adenina, guanina o uno de sus derivados. 10

3. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico del análogo de nucleósidos es timina o uno de sus derivados.

4. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico del análogo de nucleósidos es uracilo o uno de sus derivados.

5. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico del análogo 15 de nucleósidos es citosina o uno de sus derivados.

6. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico del análogo de nucleósidos es adenina o uno de sus derivados.

7. Un uso de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico del análogo de nucleósidos es guanina o uno de sus derivados. 20

8. Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (Ii)

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o 25 diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita, en donde dicha base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es timina.

9. Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos de acuerdo con 30 cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 4, en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (Iii)

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita, en donde dicha base pirimidínica o purínica de ácido 5 nucleico es uracilo.

10. Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5, en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (Iiii)

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita, en donde dicha base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es citosina. 15

11. Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 6, en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (Iiv)

Iiv

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un 25 grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita, en donde dicha base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es adenina.

12. Uso de al menos un análogo de nucleósidos en la preparación de un análogo de oligonucleótidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 7, en donde dicho análogo de nucleósidos tiene la siguiente fórmula general (Iv) 30

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, y X e Y son idénticos o diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un grupo acilo o un grupo sililo, o uno de sus derivados de amidita, en donde dicha base pirimidínica o purínica de ácido 5 nucleico es guanina.

13. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde X e Y del análogo de nucleósidos representa cada uno un átomo de hidrógeno.

14. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el análogo de nucleósidos es un derivado de amidita de mononucleósido, en el que X es 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) e Y es un grupo 2-10 cianoetoxi (diisopropilamino) fosfino (grupo amidita) .

15. Uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en donde el análogo de nucleósidos se selecciona de los siguientes:

16. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en donde dicho análogo de nucleósidos está presente en dos o más localizaciones del análogo de oligonucleótidos de tal modo que están separados uno del otro mediante uno o más nucleótidos naturales. 5

17. Un análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos que comprende una o más estructuras de la fórmula general (Ia)

en donde B es una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico o uno de sus análogos.

18. Un análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 17, que tiene la fórmula general (II)

en la que B1 y B son idénticos o diferentes y, cada uno representa una base pirimidínica o purínica de ácido nucleico, o uno de sus análogos, R es un átomo de hidrógeno, un grupo hidroxilo, un átomo de halógeno o un grupo alcoxi, W1 y W2 son idénticos o diferentes, y cada uno representa un átomo de hidrógeno, un grupo alquilo, un grupo alquenilo, un grupo alquinilo, un grupo cicloalquilo, un grupo aralquilo seleccionado de 10 bencilo y 4, 4â?-dimetoxitritilo (DMTr) , un grupo arilo, un grupo acilo, un grupo sililo, un residuo de ácido fosfórico, un nucleósido natural o un nucleósido sintético unido por un enlace fosfodiéster o un oligonucleótido o polinucleótido que contiene el nucleósido, los n1 o los n2 son idénticos o diferentes, y cada uno representa un número entero de 0 a 50, con la condición de que los n1 o n2 no sean cero al mismo tiempo y que no todos los n2 sean cero al mismo tiempo, n3 representa un número entero de 1 a 50. 15

19. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 17 o la reivindicación 18, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico se selecciona de timina, uracilo, citosina, adenina, guanina o uno de sus derivados.

20. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es timina o uno de sus derivados. 20

21. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es uracilo o uno de sus derivados.

22. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es citosina o uno de sus derivados.

23. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, 25 en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es adenina o uno de sus derivados.

24. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, en donde la base pirimidínica o purínica de ácido nucleico es guanina o uno de sus derivados.

25. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 24, en donde dicho análogo de nucleósidos está presente en dos o más localizaciones del análogo de oligonucleótidos de tal modo que están separados uno del otro mediante uno o más nucleótidos naturales.

26. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 25, en donde la longitud del análogo de oligonucleótidos es de 2 a 50, más preferiblemente de 10 a 30 unidades de nucleósidos. 5

27. El análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con la reivindicación 26, en donde la longitud del análogo de oligonucleótidos es de 2 a 10 unidades de nucleósidos.

28. Un uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde la longitud del análogo de oligonucleótidos es de 2 a 50, más preferiblemente de 10 a 30 unidades de nucleósidos.

29. Un uso de acuerdo con la reivindicación 28, en donde la longitud del análogo de oligonucleótidos es de 2 a 10 10 unidades de nucleósidos.

30. Una composición farmacéutica, que comprende un análogo de oligonucleótidos o polinucleótidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 27, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.