Procedimiento de hibridación in situ y tampón.

Un procedimiento de detección de ácidos nucleicos por medio de hibridación in situ de una muestra de ensayo celular fijada que comprende una etapa de hibridación que se lleva a cabo en un tampón de hibridación libre de formamida que comprende un componente caotrópico seleccionado entre el grupo de urea,

sales de guanidinio o guanidina y una mezcla de dos o más miembros del grupo, en el que los ácidos nucleicos son moléculas pequeñas de ARN que no es de codificación.

Procedimiento de hibridación in situ y tampón Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la hibridación in situ (ISH) sobre secciones tisulares. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento mejorado de hibridación in situ que está basado en una formulación mejorada del tampón de hibridación in situ, siendo al menos parte de dichas formulaciones no tóxicas. Junto con el Ácido Nucleico Bloqueado (LNA) , que comprende sondas de ISH, el tampón de ISH mejorado es útil para la detección de moléculas de ácido nucleico específico tales como ARNm, ARNr y en particular ARN pequeño que no es de codificación así como también en la preparación de kits de ISH destinados a la detección de dicho ARN pequeño que no es de codificación. Además, se describe un procedimiento de ISH semi-cuantitativa y la demostración del potencial diagnóstico de ISHs semi-cuantitativas.

Antecedentes de la invención La hibridación in situ (ISH) de muestras tisulares es una técnica de hibridación de ácidos nucleicos usada para investigar y localizar ácidos nucleicos diana en estructuras morfológicamente conservadas, por ejemplo, dentro de una célula, un tejido, un núcleo o un cromosoma.

Actualmente, la mayoría de las muestras patológicas se fijan de forma rutinaria y se intercalan con parafina para permitir el análisis histológico y para el almacenamiento. Se estima que la fijación con formalina y el intercalado con parafina se usan en más de un 90 % de las muestras de ensayo preparadas por los laboratorios clínicos en la preparación de muestras de ensayo para la diagnosis histológica. Los archivos de muestras de ensayo de tejidos intercaladas con parafina y fijadas con formalina bien anotadas (FFPE) son recursos inestimables para los estudios retrospectivos de enfermedades humanas, no obstante se sabe que el procedimiento FFPE así como el almacenamiento de las muestras introduce efectos adversos en la calidad del ARN (Ahlfen y col. (2007) PLos ONE 2 (12) : e 1261) . La fijación con formalina trascurre relativamente lenta, un tiempo de fijación de 16-24 h resulta convencional, y tiene como resultado una inactivación relativamente lenta de los ARNasas endógenas que invariablemente provoca cierta degradación de ARN. No obstante, numerosos estudios han mostrado que se puede usar la fijación con formalina así como otras fijaciones basadas en aldehído tales como muestras de ensayo fijadas con paraformaldehído y glutaraldehído para la hibridación in situ de ARN.

Se han descrito varios procedimientos para ISH sobre tejidos intercalados con parafina y fijados con formalina; de manera interesante todos los protocolos están formados por una etapa de hibridación en una formamida que comprende un tampón de hibridación. La formamida también se menciona como el componente de la mezcla de hibridación en los documentos EP 440.749 B1, EP 432.221 B1, US 5.521.061 y US 5.750.340 así como también en los documentos sobre ISH preparada sobre muestras de ensayo de FFPE de archivo conocidos por el inventor. No obstante, de manera importante, la formamida se caracteriza como sustancia teratogénica que debería evitarse.

Recientemente, se ha identificado un gran número de genes de ARN que no son de codificación y se han designado como microARNs (miARNs o miRs) (para revisión, véase Ke y col. 2003, Curr. Opin. Chem. Biol. 7:516-523) . Normalmente, son ARNs de 17-24 nucleótidos (nt) de largo que se procesan a partir de fracciones transcritas de horquilla endógenas más largas. Hasta la fecha, se han identificado más de 6000 miRs en humanos, lombrices, moscas de la fruta y plantas de acuerdo con la base de datos de registro de miR liberada el 11 de abril de 2008, albergada en Sanger Institute, Reino Unido.

KLOOSTERMAN W.P. y col. (NATURE METHODS, vol. 3, nº. 1, 1 de enero de 2006 (2006-01-01) , páginas 27-29) describe la detección in situ de miARNs en embriones animales usando sondas de oligonucleótidos modificadas con LNA. YAMAMICHI y col. (CLINICAL CANCER RESEARCH, vol 15, nº. 12, 15 de junio de 2009 (2009-06-15) páginas 4009-1016) describe análisis de hibridación in situ de la expresión miR-21 durante el desarrollo de cáncer colorectal usando sondas de LNA.

La importancia de microARNs en el cáncer se destaca en un artículo reciente (Barbarotto y col 2008 Int. J. Cancer. 122:969-977) que resume los paradigmas principales de la implicación de miARN en los cánceres en humanos. De este modo " (i) miARNs se alteran en todos los tipos de cáncer humanos analizados; (ii) miARNs actúa como supresores de oncogenes y tumores; (iii) las alteraciones de miARNs pueden provocar predisposición al cáncer; (iv) el perfil de miARNs es una nueva herramienta de diagnóstico para los pacientes con cáncer y (v) el perfil de miARN representa herramientas de pronóstico para los pacientes con cáncer". Por consiguiente, se necesitan procedimientos, en particular procedimientos de ISH, que se puedan usar en la localización de la expresión y cuantificación de microARNs en células específicas y tejidos de pacientes con cáncer.

Parte de la atención reciente se ha puesto en los ARNs pequeños dentro del intervalo de 17 a 25 nt y esto se debe al fenómeno de interferencia de ARN (ARNi) . ARNi es el mecanismo por el cual el ARN bicatenario conduce a la degradación de cualquier ARN que sea homólogo. ARNi está basado en un mecanismo celular antiguo y complejo que probablemente evolucionó para la protección frente a ataques víricos y elementos genéticos móviles. Una etapa crucial del mecanismo de ARNi es la generación de ARNs interferentes cortos (siARN) que son ARNs bicatenarios que tienen una longitud cada una de 22 nt.

La cuantificación de microARNs y siARNs por medio de procedimientos de ISH es muy desafiante debido al pequeño tamaño de los ARN. Además, se requiere una elevada especificidad debido a que los ARN pequeños diferentes pueden únicamente diferir con respecto a un nucleótido individual, pero presentan protocolos-ISH de día para las muestras de FFPE que con frecuencia sufren de pérdida de sensibilidad o elevados niveles de fondo.

De este modo, un procedimiento mejorado para detectar ARNs pequeños que no son de codificación por medio de ISH en muestras de ensayo intercaladas con parafina resulta altamente necesario.

La presente invención proporciona un procedimiento de ISH rápido, robusto y mejorado para la detección de ARNs que no son de codificación en muestras de FFPE. El procedimiento evita usar formamida teratogénica al tiempo que proporciona resultados de ISH incluso mejores que los obtenidos con tampones de hibridación que comprenden formamida convencional. Además, el procedimiento tiene la ventaja de que se puede usar para la cuantificación de ARNs pequeños que no son de codificación por medio de ISH en muestras de FFPE de archivo.

Sumario Antes de la presente invención, los presentes inventores pensaban que la formamida era un componente indispensable de una mezcla de hibridación ISH satisfactoria.

No obstante, los presentes inventores, sorprendentemente, han observado que se puede sustituir formamida por determinadas sustancias caotrópicas tales como, por ejemplo, urea e hidrocloruro de guanidina para obtener resultados de ISH incluso mejores que los obtenidos con tampones de hibridación que comprenden formamida convencional.

De este modo, en un primer aspecto, se describe un procedimiento para la detección de moléculas de ácido nucleico que comprenden una secuencia de nucleótidos contigua tal como ARNm por medio de hibridación in situ en muestras celulares fijas, comprendiendo dicho procedimiento una etapa de hibridación que se lleva a cabo en un tampón de hibridación libre de formamida que comprende un componente caotrópico seleccionado entre el grupo de sales de urea, guanidinio o guanidina y una mezcla de dos o más miembros del grupo.

En una realización preferida, se describe un procedimiento para la detección de ARNs pequeños que no son de codificación por medio de hibridación in situ en muestras de ensayo celulares fijadas que comprende una etapa de hibridación que se lleva a cabo en un tampón de hibridación libre de formamida que comprende un componente caotrópico seleccionado entre el grupo de urea, sales de guanidinio o guanidina y una mezcla de dos o más miembros del grupo.

En otra realización preferida, se usa el tampón de hibridación libre de formamida mejorado para detectar moléculas de ácido nucleico en secciones tisulares (FFPE) intercaladas con parafina y fijadas con formalina o en secciones tisulares congeladas (criostat) .

En un segundo aspecto, se proporciona un tampón de hibridación libre de formamida para... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de ácidos nucleicos por medio de hibridación in situ de una muestra de ensayo celular fijada que comprende una etapa de hibridación que se lleva a cabo en un tampón de hibridación libre de formamida que comprende un componente caotrópico seleccionado entre el grupo de urea, sales de guanidinio o guanidina y una mezcla de dos o más miembros del grupo, en el que los ácidos nucleicos son moléculas pequeñas de ARN que no es de codificación.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra de ensayo celular es una sección tisular embebida en parafina y fijada con formalina convencional (FFPE) .

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el componente caotrópico es urea.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sonda de hibridación in situ contiene uno o más monómeros de LNA.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprende una etapa de hibridación en el que dicha muestra de ensayo celular se pone en contacto con una disolución de hibridación que comprende:

- al menos una sonda marcada no radiactiva que comprende 7-22 nucleótidos que son capaces de hibridarse a una secuencia de ARN específica y que comprende uno o más monómeros de LNA,

- un agente de estabilización híbrido seleccionado entre el grupo de sales de cationes mono- y divalentes,

- urea en una concentración entre 0, 5 y 5 M.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la sonda de hibridación está marcada tanto en el extremo 3´como en el extremo 5´con digoxigenina.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el procedimiento comprenden además una etapa en la que la señal de hibridación se visualiza por medio de la formación de un precipitado de NBT-formazan de color azul oscuro, las muestras se someten de manera opcional a contra-tinción con rojo rápido nuclear, y además comprende una cuantificación que comprende las etapas de:

- tomar un número, tal como 8-17, de imágenes aleatorias procedente del interior del área del tumor,

- comprobar que dichas imágenes aleatorias contienen células cancerígenas evidentes, excluyendo las imágenes que no contienen, y también excluyendo las imágenes con artefactos tisulares y de tinción,

- emplear una segmentación supervisada basada en la clasificación Bayesiana entrenada para reconocer píxeles azules (es decir, precipitado de NBT-formazan) y si se tiñe con rojo rápido nuclear, píxeles rojos (es decir, píxeles coloreados con rojo rápido nuclear) y píxeles púrpura (es decir, píxeles coloreados tanto con NBTformazan como con rojo rápido nuclear) para estimar las áreas azules (B) y, si se tiñe con rojo rápido nuclear, las áreas rojas (R) y las áreas púrpura (P) ,

- cuantificar el nivel relativo de ARN por medio de estimación de bien el área total azul (TB = B + P) y/o, si se tiñe con rojo rápido nuclear, el área total azul rotativa (TBR = TB/TR, en la que el área total roja TR = R + P) y usa TB, y/o TBR como medición del nivel de ARN específico en la muestra.

8. Un tampón de hibridación libre de formamida para el uso en detección de ARNs pequeños que no son de codificación en secciones tisulares (FFPE) embebidas en parafina y fijadas con formalina convencional con sondas de LNA por medio de hibridación in situ en el que el tampón consiste en:

- un tampón que comprende un agente de estabilización híbrido seleccionado entre el grupo de sales de cationes mono- y divalentes,

- de 0, 5 a 5 M de un componente caotrópico seleccionado entre el grupo comprendido de urea, y sales de guanidinio (o guanidina) o una mezcla de dos o más miembros del grupo,

- disolución de Denhardt en una cantidad de 0 - 2x, y

- un ARN portador, tal como ARN-t de levadura, en una cantidad de 0 - 0, 5 mg/ml.

9. El tampón de hibridación de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el componente caotrópico o la mezcla de componentes caotrópicos está seleccionado entre el grupo de urea e hidrocloruro de guanidina.

10. El tampón de hibridación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, en el que el componente caotrópico es urea.

11. El tampón de hibridación de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que el tampón consiste en:

- 2, 5 X SSC,

- urea 2 M,

- 1 x Disolución de Denhardt, y

- 0, 25 mg/ml de ARN-t de levadura.

12. Un kit para la detección de ARNs pequeños que no son de codificación en tejido intercalado con parafina y fijado con formalina convencional (FFPE) por medio de hibridación in situ, comprendiendo dicho kit un tampón de hibridación libre de formamida de cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, y al menos una sonda de LNA

optimizada para la detección específica de dicho ARN pequeño no de codificación.

13. El kit de acuerdo con la reivindicación 12 en el que el ARN pequeño que no es de codificación es un microARN.

14. El kit de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 en el que la sonda de LNA está marcada tanto en el extremo 3´como en el extremo 5´con digoxigenina.

15. Un procedimiento de predicción de la supervivencia libre de enfermedad de un paciente con cáncer de colon de 15 estadio II que comprende:

a) determinar el nivel relativo de miR-21 en al menos una sección tisular representativa a partir del cáncer de colon en estadio II de dicho paciente por medio del procedimiento de la reivindicación 7

b) comparar el nivel de miR-21 en el paciente con un conjunto de niveles relativos de miR-21 obtenidos por medio del procedimiento de la reivindicación 7 a partir de un panel de referencia de muestras de cáncer de colon en estadio II obtenidas a partir de un panel de referencia de pacientes con historia de enfermedad conocida,

c) agrupar el panel de referencia en terciles de acuerdo con el nivel relativo de miR-21 determinado por medio del procedimiento de la reivindicación 7, y

d) tomar el nivel de mR-21 de dicha al menos una sección tisular representativa a partir del tumor de colon en estadio II procedente de dicho paciente que cae entro del nivel de miR-21 del tercil superior (expresión elevada)

como indicativo de una mayor probabilidad de supervivencia corta libre de enfermedad, y tomando el nivel de miR-21 de dicha al menos una sección tisular representativa procedente del tumor de colon en estadio II de dicho paciente que cae entro del nivel de miR-21 del tercil inferior (expresión baja) como indicativo de una mayor probabilidad de supervivencia larga libre de enfermedad.