Procedimiento de cuantificación de especies pequeñas de ARN.

Un procedimiento de amplificación de una molécula de microARN específica en una muestra,

comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) añadir colas poli-A a una población de moléculas de ARN en una muestra;

b) producir moléculas de ADNc de las moléculas de ARN con cola poli-A usando un cebador de extensión en una reacción de transcripción inversa; y c) amplificar las moléculas de ADNc por PCR usando un cebador directo y un cebador inverso, ambos de los cuales son específicos para dicha molécula de microARN específica,

en el que dicho cebador de extensión es una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la fórmula III:

R1-(T)y-R2 (III)

en la que R1 es una secuencia de nucleótidos del extremo 5', (T)y es una parte central de y restos consecutivos de timina, en la que y es un número entero de 5 - 50, y R2 es un motivo de secuencia VN o VNN que consiste en dos o tres restos nucleotídicos 3'-terminales respectivamente, en la que V es un resto de adenina, un resto de guanina, o un resto de citosina y N bien es un resto de adenina, un resto de guanina, un resto de citosina o un resto de timina, y en el que el cebador inverso es una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la fórmula II:

R3-(T)X-R4 (II)

en la que R3 es una secuencia de nucleótidos del extremo 5', (T)x es una parte central de x restos consecutivos de timina, en la que x es un número entero de 5 - 50, y R4 es una secuencia de nucleótidos del extremo 3' que hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos de una molécula de microARN diana, y en la que el cebador directo o R4 del cebador inverso comprende al menos un LNA.

Procedimiento de cuantificación de especies pequeñas de ARN

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento de amplificación y cuantificación de moléculas pequeñas de ARN no codificante usando tecnología de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa (qRT-PCR) .

Antecedentes de la invención Los microARN son una clase abundante de ARN no codificantes de aproximadamente 22 nucleótidos, que desempeñan importantes tareas reguladoras en el desarrollo de animales, plantas y virus. El conocimiento de los microARN se inició hace casi 15 años por el descubrimiento de lin-4, que codifica un pequeño ARN implicado en la cronología y progresión del nematodo en el ciclo vital y el desarrollo larvario de C. elegans (Lee y col. 1993 Cell 75:843-854, Wightman y col.1993 Cell 75:855-862) , pero sólo recientemente se ha reconocido que los microARN forman una clase principal de ribo-reguladores que tienen amplias funciones reguladoras en animales (Lagos-Quintana y col. 2001 Science 294:853858 Lau y col. 2001 Science 294:858-862, Lee y Ambros. 2001 Science 294:862-864) . Desde entonces, ha tenido lugar una revolución en el estudio de los microARN, y hoy en día la base de datos miRBase versión 12.0 (http://microma.sanger.ac.uk/) incluye 866 microARN humanos y la base de datos PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/) abarca 3900 artículos relacionados con microARN, lo que refleja el interés e importancia de los microARN.

Los microARN están implicados en la regulación de la expresión génica a nivel post-transcripcional mediante la degradación o bloqueo de la traducción de dianas de ARN mensajero, y se ha especulado que aproximadamente el 30% del genoma humano podría estar regulado por microARN. La importancia de los microARN también es obvio debido a su implicación en diversos procesos celulares incluyendo el desarrollo, crecimiento y proliferación, apoptosis, diferenciación, y diversas enfermedades humanas (http://www.mir2disease.org/) tales como cáncer y diabetes.

La importancia de los microARN en cáncer se pone de relieve en un reciente artículo (Barbarotto y col. 2008 Int. J. Cancer. 122:969-977) , que resumen los paradigmas principales para la implicación de los miARN en cánceres humanos: Por tanto, " (i) los miARN están alterados en cualquier tipo de cáncer humano analizado; (ii) los miARN actúan como oncogenes y supresores tumorales; (iii) alteraciones en los miARN pueden causar predisposición a cáncer; (iv) el perfilado de miARN es una nueva herramienta de diagnóstico para pacientes con cáncer y (v) el perfilado de miARN representa herramientas de pronóstico para pacientes con cáncer." Por consiguiente, procedimientos para el perfilado de expresión y cuantificación de microARN en células y fluidos corporales de pacientes con cáncer son de gran importancia. Para abordar esta necesidad, la presente invención describe el desarrollo de un nuevo ensayo robusto y fiable de qRT-PCR para mediciones de microARN.

La cuantificación de microARN por procedimientos de qRT-PCR es muy complicada debido al pequeño tamaño de los microARN de solamente 21 a 25 nucleótidos, que es el tamaño de los cebadores normalmente usados para PCR. Se han publicado soluciones a este problema en Raymond y col. RNA. 2005 Nov; 11 (11) :1737-44, Gilad y col. PLoS ONE. 2008 Sep 5; 3 (9) :e3148 y Sharbati-Tehrani y col. BMC Molecular Biology. 2008, 9:34. Raymond y col. describen un ensayo de qRT-PCR que implica una etapa de transcripción inversa específica de gen seguida de una etapa de qPCR con verde SYBR® usando un cebador directo específico de gen que contiene moléculas de ácido nucleico bloqueado (LNA) y un cebador inverso universal. Gilad y col. informan de un ensayo de qRT-PCR que implica una etapa de poliadenilación, una etapa de transcripción inversa no específica, y una etapa de qPCR que implica un cebador directo específico de gen, un cebador TaqMan específico de gen y un cebador inverso universal. Sharbati-Tehrani y col. desarrollaron un ensayo de qRT-PCR que implica una etapa de transcripción inversa específica de gen seguida de una etapa de qPCR con verde SYBR® usando un cebador directo específico de gen y 2 cebadores universales.

El documento WO 2005/098029 A2 desvela procedimientos para la detección y cuantificación de microARN.

Sin embargo, las técnicas existentes para la cuantificación de microARN por qRT-PCR no cumplen la presente necesidad de ensayos para microARN, que requieren alta especificidad que permita discriminación entre microARN muy relacionados, alta sensibilidad, bajo fondo en un procedimiento relativamente simple.

La presente invención se caracteriza por solamente una reacción de transcripción inversa para todos los microARN en una muestra y además proporciona un procedimiento de PCR extremadamente sensible con una especificidad desigual que puede usarse para la cuantificación precisa de moléculas pequeñas de ARN tales como microARN.

Sumario de la invención El establecimiento y comprensión de los patrones de desregulación de los microARN asociados con diversas enfermedades humanas tales como cánceres, exigen nuevas tecnologías mejoradas para la detección y

cuantificación de microARN en células humanas y fluidos corporales. La presente invención introduce un nuevo ensayo altamente sensible y específico para este propósito.

En un aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para amplificar y cuantificar moléculas de microARN en una muestra: En la primera etapa del procedimiento, se producen ADN complementarios (ADNc) de los microARN en una muestra por la acción concertada de dos enzimas en una reacción de un solo tubo. En primer lugar, se añaden colas de poli-A al extremo 3'-terminal de los microARN usando una poli (A) polimerasa, y en segundo lugar se hibrida un cebador de extensión a la cola poli-A y se producen los ADNc mediante una transcriptasa inversa usando el microARN como molde. La primera etapa es inespecífica y produce ADNc de todos los microARN presentes en una muestra. En la segunda etapa del procedimiento se amplifican y cuantifican los ADNc específicos en una reacción de qPCR usando series de cebadores específicos de microARN de cebadores directos e inversos que contienen monómeros de LNA.

En otro aspecto, la invención proporciona cebadores oligonucleotídicos enumerados en la Tabla 18 (SEC ID Nº 1 a SEC ID Nº 128) .

Los cebadores de la invención pueden usarse para detectar microARN de mamífero usando el procedimiento de la invención.

En otro aspecto, la invención proporciona kits para la detección de microARN de mamífero, comprendiendo los kits un cebador de extensión universal y series de cebadores directos e inversos específicos de microARN para la cuantificación de al menos un microARN, un subconjunto de microARN o todos los microARN conocidos.

La presente invención es útil para ensayos cuantitativos fiables y específicos de microARN, incluyendo ensayos para diagnosticar y pronosticar enfermedades tales como cáncer usando ensayos únicos o aplicaciones de alto rendimiento en plataformas robóticas. Las muestras que contienen ARN extraídas de diversos tipos celulares de organismos vivos, tales como mamíferos y plantas e incluyendo células infectadas por virus pueden analizarse usando el procedimiento de la invención.

Figuras La FIGURA 1 muestra las etapas implicadas en qRT-PCR específica de la presente invención. Para ilustrar el principio, la qRT-PCR de un microARN sirve como ejemplo. La etapa 1 es reacción en un tubo de todos los microARN presentes en una muestra. La etapa 2 es una qPCR específica de microARN usando pares de cebadores directos e inversos para un microARN específico. Un óvalo indica inserción de LNA en cebadores directos e inversos. Cuando el procedimiento se realiza en la práctica, a los miARN presentes en una muestra en primer lugar se les añade una cola poli-A usando una poli (A) polimerasa, que añade restos de adenina al extremo 3' de las moléculas de ARN. En segundo lugar, se hibrida un cebador de extensión, que tiene una secuencia de nucleótidos poli-T-núcleo, un motivo VN-degenerado en el extremo 3' y una cola en el extremo 5', al miARN con cola poli-A a través de hibridación con la secuencia VN-poli-T del cebador de extensión (N=C, G, A y T; V= C, G, y A) . Este cebador puede mencionarse como cebador RT universal. Posteriormente, el cebador de extensión se extiende en una reacción de transcripción inversa usando el miARN como molde. Todas estas reacciones se realizan en una reacción de un tubo. El producto de extensión primaria resultante está compuesto por el cebador de extensión y el ADN recién sintetizado, que es ADNc complementario a todos... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de amplificación de una molécula de microARN específica en una muestra, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) añadir colas poli-A a una población de moléculas de ARN en una muestra; b) producir moléculas de ADNc de las moléculas de ARN con cola poli-A usando un cebador de extensión en una reacción de transcripción inversa; y c) amplificar las moléculas de ADNc por PCR usando un cebador directo y un cebador inverso, ambos de los cuales son específicos para dicha molécula de microARN específica,

en el que dicho cebador de extensión es una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la fórmula III:

R1- (T) y-R2 (III)

en la que R1 es una secuencia de nucleótidos del extremo 5', (T) y es una parte central de y restos consecutivos de timina, en la que y es un número entero d.

5. 50, y R2 es un motivo de secuencia VN o VNN que consiste en dos o tres restos nucleotídico.

3. terminales respectivamente, en la que V es un resto de adenina, un resto de guanina, o un resto de citosina y N bien es un resto de adenina, un resto de guanina, un resto de citosina o un resto de timina, y en el que el cebador inverso es una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la fórmula II:

R3- (T) X-R4 (II)

en la que R3 es una secuencia de nucleótidos del extremo 5', (T) x es una parte central de x restos consecutivos de timina, en la que x es un número entero d.

5. 50, y R4 es una secuencia de nucleótidos del extremo 3' que hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos de una molécula de microARN diana, y en la que el cebador directo o R4 del cebador inverso comprende al menos un LNA.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que tanto el cebador directo como R4 del cebador inverso comprenden al menos un LNA.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que y es un número entero de 5 a 21.

4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, en el que el cebador de extensión comprende al menos un LNA.

5. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1 -4, en el que x de la fórmula (II) es igual a y de la fórmula (III) .

6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, en el que el cebador directo es diseñado para hibridar específicamente con la molécula de ADN complementaria de una molécula de ARN diana.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6, en el que R4 es diseñado para hibridar específicamente con el extremo 3' de un ARN diana.

8. Un procedimiento para medir la cantidad de un microARN diana en una muestra de un organismo vivo, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) amplificar el microARN diana de acuerdo con el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, b) medir la cantidad de las moléculas de ADN amplificadas.

9. Un kit para detectar al menos un microARN diana que comprende al menos una serie de cebadores específicos para la detección de un microARN diana, comprendiendo la serie de cebadores:

a) un cebador de extensión de fórmula III:

R1- (T) y-R2 (III)

en la que R1 es una secuencia de nucleótidos del extremo 5', (T) y es una parte central de y restos consecutivos de timina, en la que y es un número entero d.

5. 50, y R2 es un motivo de secuencia VN o VNN que consiste en dos o tres restos nucleotídico.

3. terminales respectivamente, en la que V es un resto de adenina, un resto de guanina, o un resto de citosina y N es bien un resto de adenina, un resto de guanina, un resto de citosina o un resto de timina, y b) un cebador inverso de fórmula II:

R3- (T) X-R4 (II)

en la que R3 es una secuencia de nucleótidos del extremo 5', (T) X es una parte central de x restos consecutivos de timina, en la que x es un número entero d.

5. 50, y R4 es una secuencia de nucleótidos del extremo 3' que hibrida específicamente con una secuencia de nucleótidos de una molécula de ARN diana, y

c) un cebador directo; en el que tanto el cebador directo como R4 del cebador inverso comprenden al menos un LNA, y en el que x de la fórmula (II) es igual a y de la fórmula (III) .

10. El kit de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el cebador de extensión comprende al menos un LNA.

11. El kit de acuerdo con las reivindicaciones 9 o 10 para detectar al menos un microARN diana de mamífero que comprende al menos una serie de cebadores específicos para la detección de un microARN diana.