Vehiculización de moléculas antigénicas en polímeros recombinantes similares a elastina.

La presente invención se refiere a un sistema basado en proteínas recombinantes similares a elastina capaces de autoensamblarse en condiciones fisiológicas para la administración de antígenos.

Dicho sistema es capaz de generar el desarrollo de una respuesta inmune eficaz en ausencia de adyuvantes.

Vehiculización de moléculas antigénicas en polímeros recombinantes similares a elastina

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se relaciona con el desarrollo de un sistema basado en proteínas recombinantes similares a elastina capaces de auto ensamblarse en condiciones fisiológicas para la administración de vacunas, en los que una o más moléculas antigénicas pueden ser incorporadas y expuestas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El impacto de la vacunación en la salud mundial es uno de los eventos más importantes en la historia de la medicina. Gracias a la vacunación muchas enfermedades están bajo control, erradicadas o, al menos, parcialmente controladas. La administración profiláctica de vacunas eficaces puede ser más efectiva que los tratamientos terapéuticos, más ecológica que el uso de agentes anti-microbianos y ofrece una mayor flexibilidad.

Entre las estrategias vacunales se encuentran las vacunas vivas, acelulares y las subunitarias o particuladas.

Las vacunas vivas son las vacunas más potentes, pero deben estar previamente atenuadas o inactivadas ya que las respuestas celulares y la generación de anticuerpos que tiene lugar son muy intensas. Esto es debido a que en las vacunas vivas, que contienen el organismo completo, están presentes todos los antígenos del patógeno y además su capacidad para replicarse hace que se incremente la cantidad de antígeno disponible para el sistema inmune. Sin embargo las vacunas vivas se han asociado con inestabilidad genética y virulencia residual.

Las vacunas acelulares, compuestas por organismos completos muertos o toxinas inactivadas, ofrecen una mayor seguridad porque mantienen sus propiedades antigénicas pero carecen de virulencia residual. Sin embargo, como no se pueden replicar en el hospedador, son menos efectivas e inducen respuestas inmunes más débiles, generando una protección durante menor tiempo y por tanto se requiere la administración de múltiples dosis de refuerzo.

Las vacunas subunitarias o particuladas, compuestas por antígenos aislados, se basan en preparaciones parcialmente purificadas de un organismo o proteínas recombinantes. Tienen efectos secundarios mínimos y es posible preparar grandes cantidades del antígeno mediante diversos métodos. Sin embargo, las vacunas subunitarias requieren del conocimiento de qué antígeno proporciona una respuesta inmune adecuada y solventar problemas como el plegamiento incorrecto o una mala presentación al sistema inmune, por lo que frecuentemente es necesario el uso de adyuvantes. El único adyuvante aprobado para su uso en humanos son las sales de aluminio, denominadas genéricamente como Alum; esta sustancia presenta un buen perfil de seguridad pero diversos estudios realizados con diferentes vacunas de naturaleza proteica demuestran que su capacidad adyuvante es bastante limitada y además es un hecho constatado que la respuesta inducida es fundamentalmente humoral, es decir Th2 (Gupta et al. 1998, Adv. Drug Del, Rev. 32: 155-172) . Además el Alum no es efectivo en la inducción de una respuesta inmunológica a nivel de mucosas. Por último se ha observado que también puede inducir IgE, lo cual ha sido asociado con reacciones alérgicas. En algunos casos en los que es necesaria una respuesta celular basada en células T CD4 o CD8, el uso de Alum como adyuvante no es suficiente, por lo que es necesario el desarrollo de nuevos adyuvantes y formulaciones.

La inducción de una respuesta inmune apropiada es esencial para una vacuna eficaz y depende de muchos factores, tales como la ruta de administración, la dosis, la duración, el número y la frecuencia de las inmunizaciones, el uso de adyuvantes, etc.

La etapa crucial de una respuesta inmune fisiológica comienza con la habilidad de las células presentadoras de antígeno de procesar los antígenos y presentarlos en su superficie. Parece que las células dendríticas juegan un papel importante regulando la cantidad, calidad y duración de la respuesta inmune adaptativa (Pulendran B. Cell 124 (2006) 849-863) .

La activación apropiada de células T específicas de antígeno es crítica para la inducción de una respuesta inmune adaptativa eficaz y hay varios factores que pueden afectar este proceso. Entre ellos destacan la presencia de señales coestimuladoras y características de la partícula como el tamaño o la superficie, así como la densidad del epítopo y la ruta de administración.

El tamaño de las partículas juega un papel importante en la adyuvanticidad. Está ampliamente aceptado que las formulaciones para la administración basadas en vacunas particuladas son más inmunogénicas que los antígenos solubles in vivo (Kanchan V. et al, Biomaterials 28 (2007) 5344-5357) ya que pueden iniciar la captación apropiada y el procesamiento del antígeno por parte de las células presentadoras de antígeno o de las células dendríticas. Se han desarrollado una gran variedad de sistemas adyuvantes de liberación particulados basados en emulsiones lipídicas, nano y micro partículas biodegradables y biocompatibles, complejos inmunoestimuladores, virosomas y partículas similares a virus. Las formulaciones particuladas tienen un tamaño inferior a 0, 5 μm y son internalizadas por las células presentadoras de antígeno por una combinación de vías endocíticas y las partículas mayores de 0, 5 μm son internalizas por los macrófagos mediante fagocitosis. Esto está de acuerdo con las observaciones de que los sistemas nanoparticulados inducen una fuerte respuesta inmune tanto humoral como celular (Singh M. Pharmaceutical research 19 (2002) 717-728) .

Los sistemas de liberación particulados, además de la capacidad de activar la inmunidad innata, incrementa la duración de la presencia del antígeno, lo que es importante para una respuesta de las células T (Antonio J. et al, Advanced drug deliver y reviews 59 (2007) 478-490) . La mayoría de estos sistemas de liberación actúan por dos mecanismos, creando un depósito de antígeno in vivo para la liberación del antígeno durante un periodo de tiempo largo e incrementando la captación fagocítica de la partícula cargada con el antígeno por las células presentadoras de antígeno. Tienen además otras ventajas, como la posibilidad de incorporar múltiples péptidos.

Se han descrito diversos polímeros biodegradables para la liberación de antígenos, incluyendo ácido polisebácido (AP) , propano 1, 3 bis (p-carboxifenoxi) (PPC) , ácido poliglicólico (AG) , polisacáridos como quitosan, dextrano, polietilenglicol (PEG) , etc... Además se han desarrollado una nueva clase de polímeros para su uso en vacunas, denominados dendrímeros, como los derivados de polipropilen imina (PPI) , y poliamido amina (PAMAM) (Heeaard P. et al., Bioconjugate Chem 21 (2010) 405-418) .

Sin embargo, los sistemas de liberación conocidos presentan algunas limitaciones como el daño frecuente en el antígeno durante la microencapsulación, la baja eficacia de encapsulación y la liberación inicial mínima del antígeno atrapado. Además, los factores ambientales como pH, temperatura, alta presión, y agitación entre otros puede dañar las proteínas, reduciendo su actividad biológica (Derek T. Methods 40 (2006) 10-19) . Estos problemas hacen que los sistemas poliméricos descritos hasta el momento hayan sido usados solamente en veterinaria y no sea posible emplearlos para uso humano.

Floss D.M. et al., (J Biomed Biotechnol.; 2010: 274346) describe la expresión e inmunogenicidad de una proteína de fusión basada en un polímero similar a elastina (Elastin like Polymer ELP) junto a dos grandes antígenos (ESAT-6 y Ag85B) de la bacteria M. tuberculosis (TBAg 40.8kDa) . El ELP utilizado contiene 100 repeticiones del pentapéptido VPGXG donde X indica Glicina, Valina o Alanina sin bloques definidos. Dicha proteína es producida en plantas, tratada mediante ciclado de transición inverso (ITC) y utilizada en ensayos de inmunogenicidad. Si bien los autores verifican que la inclusión de la parte ELP aumenta la tasa de expresión y acumulación del antígeno en planta, no demuestran que los polipéptidos resultantes (ELP desnudo y TBAg-ELP) estén puros antes de ser utilizados. Además, los polímeros ensayados no permiten una liberación eficaz del antígeno, por lo que es necesaria su formulación con sistemas liposomales adyuvantes como DDA/MPI y DOTAP. A pesar de ello, la respuesta inmune humoral generada es poco intensa y de corta duración. El nivel de anticuerpos frente al filtrado proteico de la micobacteria al inmunizar con el polipéptido TBAg-ELP sólo resultó eficaz con la dosis de 10 μg al aumentar 10 veces la sensibilidad de la técnica de detección, y perdió intensidad en la siguiente medida temporal, por lo que no induce la maduración... [Seguir leyendo]

1. Un conjugado que comprende (i) un polipéptido similar a elastina que comprende

(a) al menos una región hidrofílica de secuencia [ (X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2]n y

(b) al menos una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G) m en donde X1 y X3 son aminoácidos de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, X4 y X5 son G o P, , n es entre 5 y 10 y m es entre 10 y 100.

y

(ii) al menos una molécula antigénica seleccionada del grupo formado por un péptido, un ácido nucleico o un polisacárido

2. Conjugado según la reivindicación 1 en donde n es 10.

3. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 en donde X1 es V.

4. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en donde X2 es E.

5. Conjugado según la reivindicación 4 en donde el componente (a) tiene la secuencia [ (VPGVG) 2VPGEG (VPGVG) ]10.

6. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en donde m es 60.

7. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en donde X3 es V.

8. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en donde X4 es G.

9. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en donde X5 es P.

10. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en donde el componente (b) tiene la secuencia (VGIPG) 60.

11. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente una región polipeptídica que permite la traslocación de dicho polipéptido a través de membranas biológicas.

12. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente al menos una secuencia de adhesión celular.

13. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente al menos una secuencia con capacidad de unir ácidos nucleicos.

14. Conjugado según la reivindicación 13 en donde la secuencia con capacidad de unir ácidos nucleicos es una región rica en aminoácidos básicos.

15. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 en donde el polipéptido similar a elastina comprende adicionalmente un péptido de inicio de la traducción.

16. Conjugado según la reivindicación 15 en donde el péptido de inicio de la traducción es la secuencia descrita en SEQ ID NO:3.

17. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en donde el componente (ii) es un péptido antigénico.

18. Conjugado según la reivindicación 18 en donde el péptido antigénico es un péptido antigénico de

M. tuberculosis.

19. Conjugado según la reivindicación 18 en donde el péptido antigénico de M. tuberculosis es un péptido de la proteína Hsp 16.3 (SEQ ID NO: 4) .

20. Conjugado según la reivindicación 19 en donde el péptido antigénico de la proteína Hsp 16.3 de M. tuberculosis es el péptido con secuencia SEQ ID NO: 5.

21. Conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20 en donde los componentes (i) y (ii) forman una única cadena polipeptídica.

22. Conjugado según la reivindicación 21 en donde el componente (ii) se encuentra en posición Cterminal con respecto al componente (i) .

23. Conjugado según la reivindicación 21 en donde el componente (ii) se encuentra en posición Nterminal con respecto al componente (i) .

24. Conjugado según la reivindicación 23 que comprende adicionalmente una región que promueve la traslocación a través de membranas biológicas en posición N-terminal con respecto al componente (i) .

25. Nanopartícula formada por la asociación de dos o más conjugados según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24.

26. Nanopartícula según la reivindicación 25 en donde dicha nanopartícula tiene un diámetro inferior a 200 nm.

27. Polinucleótido que codifica un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24.

28. Vector que contiene un polinucleótido según la reivindicación 27.

29. Célula que contiene el conjugado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, la nanopartícula según la reivindicación 25 o 26, el polinucleótido según la reivindicación 26 o el vector según la reivindicación 27.

30. Uso de un conjugado según las reivindicaciones 1 a 24, de una nanopartícula según las reivindicaciones 25 o 26, de un polinucleótido según la reivindicación 27, de un vector según la reivindicación 28 o de célula según la reivindicación 29 para la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad para estimular y/o inducir la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica.

31. Uso según la reivindicación 30 en donde el componente (ii) es un antígeno de M.tuberculosis y en donde la respuesta inmune de un individuo frente a la molécula antigénica es una respuesta inmune frente a tuberculosis.

32. Uso según la reivindicación 30 o 31 en donde el polipéptido, la nanopartícula, el polinucleótido, el vector o la célula es administrada por vía mucosa o tópica.

33. Polinucleótido adecuado para la expresión de una proteína de fusión formada por un polipéptido similar a elastina y un polipéptido antigénico de interés que comprende una secuencia que codifica dicho polipéptido similar a elastina en donde dicho polipéptido similar a elastina comprende:

(a) una región hidrofílica de secuencia [ (X1PGX1G) 2 X1PGX2G (X1PGX1G) 2]n en donde X1 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X2 es un aminoácido de cadena lateral hidrofílica, y n es un número entero entre 5 y 10 y

(b) una región hidrofóbica de secuencia (X3X4IX5G) m en donde X3 es un aminoácido de cadena lateral hidrofóbica, X4 y X5 son G o P y m es entre 10 y 100.

34. Polinucleótido según la reivindicación 33 en donde n es 10, en donde X1 es V y/o en donde X2 es

E.

35. Polinucleótido según la reivindicación 34 en donde la región hidrofílica codificada por la primera secuencia tiene la secuencia [ (VPGVG) 2VPGEG (VPGVG) ]10.

36. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35 en donde m es 60, en donde X3 es V, en donde X4 es G y/o en donde X5 es P.

37. Polinucleótido según la reivindicación 33 en donde la región hidrofóbica codificada por la segunda secuencia tiene la secuencia (VGIPG) 60.

38. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 37 que comprende adicionalmente una secuencia iniciadora de la traducción.

39. Polinucleótido según la reivindicación 38 en donde la secuencia iniciadora de la traducción codifica un péptido que comprende la secuencia de SEQ ID NO:3.

40. Polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39 que comprende adicionalmente uno varios sitios de clonaje que permita insertar un polinucleótido de interés en dicho polinucleótido de forma que la expresión de dicho polinucleótido de lugar a una proteína de fusión formada por el polipéptido similar a elastina y el polipéptido codificado por el polinucleótido de interés.

41. Vector de expresión que comprende un polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 33 a 40.

Fig. 1 Fig. 2

A

0, 5

0, 4

0, 3

0, 2

0, 1

0, 0

T (ºC)

Fig. 3

Abs (OD350)

Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6

Fig. 7

Fig. 8

Fig. 9

Fig. 10

anti Ag anti CFP

Absorbancia a 370nm

Absorbancia a 370nm

0, 5 0, 4 0, 3 0, 2 0, 1

0, 10 0, 08 0, 06 0, 04 0, 02

Ig M

Ig G

Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control

Fig. 11

anti Ag-ELP anti ELP

Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Ag-ELP Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control Dosis 1 Dosis 2 ELP Ag Control

Fig. 11 (cont.)