Utilización de TDE para el aislamiento de ácidos nucleicos.

Composición que comprende éter dimetílico de tetraetilenglicol (≥TDE), un tampón acuoso y un agente caotrópico

Utilización de TDE para el aislamiento de ácidos nucleicos La presente invención se refiere a la purificación de ácidos nucleicos. Particularmente, la invención se refiere a métodos de adsorción de ácidos nucleicos presentes en una solución acuosa de adsorción a un sustrato sólido.

Antecedentes de la invención Desde que la estructura del ADN fue descifrada por Watson y Crick en 1953 (Watson J.D. y Crick F.H.C., Nature 171:737-738, 1953, la investigación y manipulación de los ácidos nucleicos se ha convertido en parte integral de la bioquímica y la biología molecular. A pesar de la disponibilidad de varios métodos de aislamiento y kits comerciales para llevar a cabo dichos métodos, los nuevos avances para el aislamiento o la purificación fácil y sencilla de ácidos nucleicos con alto rendimiento y pureza siguen siendo de gran importancia.

Los ácidos nucleicos son altamente susceptibles a la degradación enzimática. En 1968, Cox describió el agente caotrópico HCl de guanidina como inhibidor de la actividad enzimática de nucleasa (Cox R.A., Methods Enzymol. 12B:120-129, 1968) . Además de un fuerte efecto desnaturalizante de las proteínas, las concentraciones elevadas de agentes caotrópicos median en la lisis celular. Por lo tanto, los agentes caotrópicos, particularmente el isotiocianato de guanidina, se utilizan ampliamente en el aislamiento de ácidos nucleicos.

Un primer principio del aislamiento de los ácidos nucleicos a partir de una muestra biológica utiliza un solvente orgánico, particularmente fenol, para la separación de ácidos nucleicos de los componentes orgánicos restantes en la muestra. Tras la extracción con fenol se lleva a cabo una precipitación salina del ácido nucleico a partir de una fase acuosa (Stallcup M.R. y Washington L.D., J. Biol. Chem. 258:2802-2807, 1983, y Schmitt M.E. et al., Nucl. Acids Res. 18:3091-3092, 1990) . Aunque este método resulta en un elevado rendimiento y pureza de ácidos nucleicos, las desventajas principales son la utilización de reactivos tóxicos, y que el procedimiento resulta largo y laborioso. Debido a dichas desventajas, este método de aislamiento no puede automatizarse, o sólo en un grado muy limitado.

Otro método de aislamiento de ácidos nucleicos utiliza un material inorgánico sólido, particularmente sílice, al que se adsorben ácidos nucleicos de una fase líquida acuosa, tal como un lisado de una muestra biológica. En 1979, Vogelstein y Gillespie describieron un método para aislar ácidos nucleicos a partir de secciones de gel de agarosa mediante la unión de ácidos nucleicos a partículas de sílice en presencia de yoduro sódico altamente concentrado (Vogelstein B. y Gillespie D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:615-619, 1979) .

Además, se ha encontrado que la unión de ácidos nucleicos a la fase sólida se incrementaba al añadir detergentes aniónicos, catiónicos o neutros, en particular Triton-X100, dodecilsulfato sódico, NP40 y Tween-20.

La adsorción de un ácido nucleico a la fase sólida habitualmente se lleva a cabo en presencia de un desnaturalizante potente, tal como un agente caotrópico (Boom R. et al., J. Clin. Microbiol. 28:495-503, 1990; patente US nº 5.234.809) . Para el procedimiento de aislamiento, el material biológico se mezcla con una solución que contiene el desnaturalizante. La mezcla resultante se pone en contacto con el material de fase sólida, de manera que las moléculas de ácidos nucleico se unen a la superficie de la fase sólida. A continuación, el material sólido se lava con soluciónes que contienen concentraciones salinas caotrópicas decrecientes y concentraciones crecientes de alcohol, en particular de etanol, con el fin de purificar adicionalmente los ácidos nucleicos unidos respecto de otros materiales orgánicos y agentes contaminantes. En la última etapa, el material sólido se pone en contacto con una solución pobre en sales o agua bajo pH alcalino con el fin de separar el ácido nucleico unido de la fase sólida. El flujo de trabajo completo comprende una etapa de lisis de la muestra, una etapa de unión, una o más etapas de lavado y una etapa de elución (desorción) .

La fase sólida puede disponerse en diferentes conformaciones. En un primer diseño, la fase sólida presenta forma de tejido y se encuentra incluida en un dispositivo de plástico. Un ejemplo de la misma es una columna MicroSpin (patente EP nº 0 738 733) . Este diseño se utiliza preferentemente en flujos de trabajo ejecutados manualmente. En un segundo diseño, las partículas de sílice magnéticas se utiliza como fase sólida (Bartl K. et al., Clin. Chem. Lab. Med. 36:557-559, 1998) . Este diseño se utiliza preferentemente en flujos de trabajo automatizados.

Una mejora adicional de dicho método se ha observado al añadir alcohol alifático (es decir, etanol o isopropanol) o polietilenglicol a la solución en la etapa de unión (patente US nº 6.383.393) .

La patente US nº 6.905.825 da a conocer la adición de solventes orgánicos al tampón de unión. Estos solventes orgánicos comprenden los éteres alifáticos siguientes: éter dimetílico de etilenglicol, éter dietílico de etilenglicol, éter dimetílico de propilenglicol, éter dietílico de propilenglicol, éter dimetílico de dietilenglicol, éter dietílico de dietilenglicol, tetrahidrofurano y 1, 4-dioxano; los ésteres alifáticos siguientes: propilenglicol monometil-éter acetato y lactato de etilo, y las cetonas alifáticas hidroxiacetona, acetona y metiletil-cetona.

La patente US nº 2005/0079535 da a conocer la utilización de acetona, acetilacetona, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, dietilcetona, metiletilcetona, metilpropilcetona, isobutilmetilcetona, γ-butirolactona, γ-valerolactona, carbonato de propileno y N-metil-2-pirrolidona, así como la utilización del diéter cíclico dioxano en el tampón de unión, con el fin de adsorber un ácido nucleico a una fase sólida tal como sílice.

La patente US nº 2006/0166368 A1 da a conocer una solución líquida que comprende éter dimetílico de tetraetilenglicol (TED) en un tampón que contiene (1) un componente orgánico miscible en agua tal como metanol, etanol, 1-propanol ó 2-propanol, etilenglicol, propilenglicol, glicerol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, formamida, dimetilformamida, diglima, triglima o tetraglima, a una concentración de hasta 50% (base volumen) , (2) un componente ácido tal como ácido acético, ácido fórmico, ácido láctico, ácido propiónico, ácido fosfórico, ácido tricloroacético, ácido trifluoroacético, ácido cítrico, ácido oxálico o ácido hidroclórico, a una concentración de hasta 20% (base volumen) , (3) un tampón tal como fosfato sódico, acetato sódico, formato sódico o citrato sódico, a un pH de entre 1 y 6, y a una concentración de entre 5 y 200 mM, y (4) un detergente tal como dodecilsulfato sódico, TRITON® X-100, SB3-10 y TWEEN®20) a una concentración de entre 0, 005% y 1% (en una base de peso-volumen) . La solución líquida se utiliza como solvente de determinados pigmentos que sirven como marcajes selectivos en la bioquímica de proteínas y particularmente para métodos de detección de proteínas.

Las propiedades químicas de los reactivos utilizados en el procedimiento de aislamiento/purificación de ácidos nucleicos determinan la calidad de los ácidos nucleicos (rendimiento, pureza y tamaño) , así como su comportamiento en flujos de trabajo posteriores, incluyendo reacciones enzimáticas basadas en polimerasas o transcriptasas inversas (Mullis K. y Faloona F.A., Methods Enzymol. 155:335-350, 1987) . Además, algunas propiedades adicionales de los reactivos, como la toxicidad, así como aspectos físicos químicos como el punto de ignición y la presión de vapor son de gran importancia.

Recientemente el análisis de las moléculas pequeñas de ARN, de 15 a 20 nucleótidos, ha despertado un fuerte interés. Se han investigado especialmente microARN (ARNmi) y ARN interfirientes pequeños (ARNip) , los cuales presentan un efecto fuerte sobre la traducción de ARN mensajero específicos. Además, para otros tipos de ARN pequeño, tales como ARNt, ARNr 5S y 5.8S, así como ARN nuclear pequeño (ARNnp) y ARN nucleolar pequeño (ARNnop) implicado en el procesamiento del ARNm y el ARNr, resultan necesarios procedimientos de aislamiento selectivo.

Los métodos para aislar dichas moléculas de ARN pequeño de manera selectiva han sido descritos en la patente US nº 2005/0059024, de Conrad, y en la patente WO nº 2005/012487, de Madden et al. Con el fin de aislar moléculas de ARN pequeño en ambos métodos, resultan necesarias concentraciones elevadas de alcohol, del orden de 70%, para unir eficientemente el ARN pequeño a un soporte sólido. Lo anterior incrementa considerablemente... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende éter dimetílico de tetraetilenglicol (=TDE) , un tampón acuoso y un agente caotrópico.

2. Composición según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de TDE en la composición es de entre 10% y 75%, medida en volumen por volumen.

3. Composición según la reivindicación 2, caracterizada porque la concentración de TDE en la composición es de entre 30% y 45%, medida en volumen por volumen.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la composición comprende además un compuesto seleccionado de entre el grupo que consiste de 1, 3-dioxolán, 1, 3-dioxano, 5hidroxi-1, 3-dioxano y 4-hidroximetil-1, 3-dioxolano, y una mezcla de los mismos.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque la composición contiene además un detergente.

6. Composición según la reivindicación 5, caracterizada porque el detergente se seleccione de entre el grupo que consiste de dodecilsulfato sódico, dodecilsulfato de litio, bromuro de cetiltrimetilamonio, ácido desoxicólico, lauroilsarcosina sódica, Triton X-100, Tween-20, β-D-glucósido de octilo, Nonidet P40, Brij® 35 P o sulfobetaína 14.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque el pH de la composición es de entre 4 y 7, 5. 20

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque el agente caotrópico se selecciona de entre el grupo que consiste de hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina, urea, perclorato de álcali y mezclas de los mismos.

9. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque la concentración del agente caotrópico es de entre 0, 5 M y 10 M.

10. Utilización de TDE para adsorber un ácido nucleico a una fase sólida.

11. Método de adsorción de un ácido nucleico de una muestra sobre una fase sólida, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar el ácido nucleico en una muestra, en la que la muestra se disuelve en una composición líquida según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, seguido de:

(b) proporcionar la fase sólida y poner en contacto la composición líquida de la etapa (a) con la fase sólida, adsorbiendo de esta manera el ácido nucleico a la fase sólida.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque la fase sólida comprende un sustrato de sílice poroso o no poroso.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque la fase sólida comprende un sustrato seleccionado de entre el grupo que consiste de fibras de vidrio y fibras de cuarzo.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado porque la fase sólida comprende partículas magnéticas con una superficie de sílice.

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14, que comprende las etapas adicionales de:

(c) separar la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido respecto de la fase líquida,

(d) opcionalmente lavar con una solución de lavado la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido, de manera que el ácido nucleico permanezca unido a la fase sólida, seguido de

(e) poner en contacto la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido, con una solución de desorción, de manera que se desorbe el ácido nucleico de la fase sólida y se disuelve el ácido nucleico en la solución, seguido de:

(f) separar la solución con el ácido nucleico respecto de la fase sólida, purificando de esta manera el ácido nucleico, y opcionalmente

(g) precipitar el ácido nucleico de la solución de la etapa (f) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando adicionalmente de esta manera el ácido nucleico.

16. Método según la reivindicación 15, caracterizado porque se lleva a cabo la etapa (d) y la solución de lavado comprende agua y TDE.

17. Método según la reivindicación 16, caracterizado porque la solución de lavado comprende además una sal.

18. Composición que comprende TDE y partículas magnéticas con una superficie de sílice.

19. Método para purificar un ácido nucleico de bajo peso molecular, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar el ácido nucleico en una muestra, en la que la muestra se disuelve en una composición líquida que comprende un tampón acuoso, TDE a una concentración de entre 10% y 75%, medida en volumen por volumen, y un agente caotrópico, seguido de:

(b) proporcionar una fase sólida y poner en contacto la composición líquida de la etapa (a) con la fase sólida, seguido de:

(c) separar la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido respecto de la fase líquida,

(d) lavar con una solución de lavado la fase sólida de la etapa (c) , en la que la solución de lavado comprende un solvente orgánico a una concentración de entre 40% y 100%, seguido de:

(e) poner en contacto la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido, con una solución acuosa de desorción que contiene solutos a una concentración inferior a la composición de la etapa (a) , desorbiendo de esta manera el ácido nucleico de la fase sólida y disolviendo el ácido nucleico en la solución, seguido de:

(f) separar la solución con el ácido nucleico respecto de la fase sólida, purificando de esta manera el ácido nucleico, y opcionalmente

(g) precipitar el ácido nucleico de la solución de la etapa (f) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando adicionalmente de esta manera el ácido nucleico.

20. Método según la reivindicación 19, caracterizado porque en la etapa (a) la concentración de TDE en la composición es de aproximadamente 40%, medida en volumen por volumen.

21. Método para purificar un ácido nucleico de bajo peso molecular, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar el ácido nucleico en una muestra, en la que la muestra se disuelve en una composición líquida que comprende un tampón acuoso, TDE a una concentración de entre 5% y 30%, medida en volumen por volumen, y un agente caotrópico, seguido de:

(b) proporcionar una primera fase sólida y poner en contacto la composición líquida de la etapa (a) con la primera fase sólida, y separar la fase líquida de la primera fase sólida, seguido de:

(c) mezclar una cantidad adicional de TDE con la fase líquida de la etapa (b) , ajustando de esta manera la concentración de TDE en la fase líquida de la etapa (b) a entre 20% y 70%, medido en volumen por volumen, de manera que la concentración inicial de TDE en la fase líquida se incrementa en 1, 3 veces o más, seguido de:

(d) proporcionar una segunda fase sólida y poner en contacto la composición líquida de la etapa (a) con la segunda fase sólida, seguido de:

(e) lavar con una solución de lavado la segunda fase sólida de la etapa (d) , en la que la solución de lavado comprende un solvente orgánico a una concentración de entre 50% y 100%, seguido de:

(f) poner en contacto la segunda fase sólida de la etapa (e) con una solución acuosa de desorción que contiene solutos a una concentración inferior a la composición de la etapa (a) , desorbiendo de esta manera el ácido nucleico de la fase sólida y disolviendo el ácido nucleico en la solución, seguido de: (g separar la solución con el ácido nucleico respecto de la fase sólida, purificando de esta manera el ácido nucleico, y opcionalmente

(h) precipitar el ácido nucleico de la solución de la etapa (f) y aislar el ácido nucleico precipitado, purificando adicionalmente de esta manera el ácido nucleico.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 19 y 20 ó el método según la reivindicación 21, caracterizado porque:

(a) el ácido nucleico es de cadena sencilla y el tamaño del ácido nucleico purificado es de entre 10 y 150 bases, o

(b) el ácido nucleico es de doble cadena y el tamaño del ácido nucleico purificado es de entre 5 y 75 bases.

23. Método según la reivindicación 22, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN.

24. Kit de partes, que comprende un manual de instrucciones, material de empaquetamiento, recipientes, y:

(a) TDE,

(b) una solución madre concentrada de una sal tampón y un agente caotrópico seleccionado de entre el grupo que consiste de hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina y perclorato de álcali, y yoduro de álcali, y

(c) material cromatográfico y de filtración que comprende un material con una superficie capaz de interactuar con los residuos fosfato del esqueleto de los ácidos nucleicos.

25. Kit de partes, que comprende un manual de instrucciones, material de empaquetamiento, recipientes, y:

(a) una suspensión en TDE de partículas magnéticas recubiertas de sílice, y

(b) una solución madre concentrada de una sal tampón y un agente caotrópico seleccionado de entre el grupo que

consiste de hidrocloruro de guanidina, tiocianato de guanidina, isotiocianato de guanidina y perclorato de álcali, y yoduro de álcali.

26. Método para determinar la presencia de un ácido nucleico en una muestra, que comprende las etapas de:

(a) formar una composición que contiene:

(i) la muestra,

(ii) un tampón acuoso,

(iii) un agente caotrópico,

(iv) TDE, en la que la muestra se disuelve en la composición líquida,

(b) poner en contacto la composición de la etapa (a) con la fase sólida, adsorbiendo de esta manera el ácido nucleico a la fase sólida,

(c) separar la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido respecto de la fase líquida,

(d) opcionalmente lavar con una solución de lavado la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido, seguido de:

(e) poner en contacto la fase sólida con el ácido nucleico adsorbido, con una solución acuosa de desorción que contiene solutos a una concentración inferior a la composición de la etapa (a) , desorbiendo de esta manera el ácido nucleico de la fase sólida y disolviendo el ácido nucleico en la solución, seguido de:

(f) separar la solución con el ácido nucleico respecto de la fase sólida, purificando de esta manera el ácido nucleico, y

(g) detectar en la solución de la etapa (f) la presencia del ácido nucleico, determinando de esta manera la presencia del ácido nucleico.

27. Método según la reivindicación 26, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN o ADN.

28. Método según cualquiera de las reivindicaciones 26 y 27, caracterizado porque el ácido nucleico es ARN y la etapa (g) comprende (i) transcribir inversamente el ARN para formar un ADNc, (ii) amplificar seguidamente, mediante la reacción en cadena de la polimerasa, el ADNc, (iii) detectar la presencia del ADNc, determinando de esta manera la presencia del ácido nucleico.