Uso de maquinaria de replicación de AAV para producción de proteína mejorada.

Método para la producción de un producto de gen de interés, comprendiendo el método las etapas de:



a) proporcionar una célula de insecto que comprende:

i) una primera casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el producto de gen deinterés que está operativamente enlazado a un promotor capacitado para activar expresión del producto de gen en lacélula de insecto, y en el que la primera casete de expresión está flanqueada por cualquiera de los lados porsecuencias de nucleótido de repetición terminal invertida (ITR) de virus adeno-asociado (AAV);

ii) al menos una segunda casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menosuna proteína Rep de AAV que está operativamente enlazada a un promotor capacitado para activar expresión de lasproteínas Rep en la célula de insecto;

b) cultivar la célula de insecto definida en a) bajo una condición que conduce a la expresión de la primera y lasegunda casetes de expresión, y

c) opcionalmente, recuperar el producto de gen de interés,

en el que la célula de insecto no comprende una proteína Cap parvoviral ni una secuencia de nucleótido quecodifique una proteína Cap parvoviral, y en el que la primera y la segunda casetes de expresión están comprendidasen los mismos uno o dos vectores baculovirales separados.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/NL2008/050613.

Solicitante: UniQure IP B.V.

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: MEIBERGDREEF 61 1105 BA Amsterdam Zuidoost PAISES BAJOS.

Inventor/es: HERMENS,WILHELMUS THEODORUS JOHANNES MARIA CHR, NOORDMAN,YVET, BAKKER,ANDREW CHRISTIAN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A01K67/027 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA.A01K CRIA; AVICULTURA, PISCICULTURA, APICULTURA; PESCA; OBTENCION DE ANIMALES, NO PREVISTA EN OTRO LUGAR; NUEVAS RAZAS DE ANIMALES.A01K 67/00 Cría u obtención de animales, no prevista en otro lugar; Nuevas razas de animales. › Nuevas razas de vertebrados.
  • C07K14/015 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Parvoviridae, p. ej. virus de la panleucopenia felina, parvovirus humano.
  • C12N15/63 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/866 C12N 15/00 […] › Vectores báculovirales.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

PDF original: ES-2426091_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Uso de maquinaria de replicación de AAV para producción de proteína mejorada.

Campo de la invención La presente invención se refiere al sector de las construcciones de ácido nucleico y de líneas celulares que permiten la expresión incrementada de proteína objetivo endógena o heteróloga.

Antecedentes de la invención La producción industrial de proteínas recombinantes cubre un área amplia de desarrollos y aplicaciones. La producción de proteína recombinante por célula o por litro de medio de cultivo es una baza importante para el desarrollo de sistemas de producción mejorados.

Los métodos actuales de expresar genes en células de mamífero o de insecto para la producción industrial de proteínas recombinantes, anticuerpos monoclonales o vacunas incluyen el uso de líneas de células estables o la transfección de células productoras utilizando vectores, tal como los que se derivan de adenovirus, virus Sindbis, o baculovirus. Otros métodos para la introducción de un gen exógeno en una célula de mamífero o célula de insecto incluyen inyección directa de ADN, el uso de conjugados de ligando – ADN, el uso de conjugados de adenovirus – ligando – ADN, precipitación de fosfato de calcio, y métodos que utilizan un complejo de liposoma- o de policatión – ADN.

En la naturaleza, los baculovirus son virus que contienen ADN de doble cadena, que infectan una diversidad de especies de insectos diferentes. La familia de los baculovirus puede ser dividida en dos géneros, uno de los cuales son los nucleopoliedrovirus. Los nucleopoliedrovirus inducen la formación de cuerpos de oclusión paracristalinos en los núcleos de células anfitrión infectadas. Estos cuerpos de oclusión están compuestos principalmente por una proteína viral simple, la polihedrina, que se expresa a niveles muy altos. El gen de polihedrina ha sido clonado y secuenciado, y sus características únicas han proporcionado la base para el desarrollo de una serie de vectores de expresión de baculovirus (Summers, M.D. y Smith, G.E., TAES Bull. 1555 (1987) ; Luckow, V.A. y Summers, M.D., Biotechnology 6:47-55 (1988) ; Miller, L.K., Ann. Rev. Microbiol. 42:177-179 (1988) ; Patente U.S. núm. 4.745.051,

G.E. Smith y M.D. Summers (depositada el 27 de Mayo de 1983; concedida el 17 de Mayo de 1988) ) .

El sistema de expresión de baculovirus usado junto con células de insecto ha resultado estar bien establecido para la producción de proteínas, debido a sus ventajas en cuanto a versatilidad y velocidad. En el sistema de expresión de baculovirus, se utiliza un vector baculoviral recombinante para introducir un gen de interés en células de insecto. La infección de las células de insecto da como resultado la replicación del genoma de vector de baculovirus recombinante, incrementando con ello el número de plantillas genéticas que codifican el gen de interés y que incrementan el nivel de expresión de proteína recombinante.

La expresión de proteína mediada por baculovirus proporciona un plegamiento correcto de las proteínas recombinantes, así como la formación de enlace disulfuro, la oligomerización y otras modificaciones posttraslacionales importantes que proporcionan actividad y función biológica apropiadas. De hecho, el plegamiento de proteína y el procesamiento post-traslacional de una proteína eucariótica en células de insecto es completamente 45 comparable a líneas de células de mamífero. Además, las células de insecto pueden hacerse crecer en un medio libre de suero, lo que constituye una ventaja en términos de costes y también de bioseguridad. Otra ventaja de la expresión de proteína mediada por baculovirus es que los baculovirus solamente infectan insectos lepidópteros, por lo que no son infecciosos para los vertebrados y resultan ser agentes de manipulación genética relativamente seguros. Además, se sabe que el sistema de expresión de baculovirus es una plataforma tecnológica que da como resultado altos niveles de expresión de proteína en células de insectos. Una desventaja del sistema de expresión de baculovirus consiste en que la infección de la célula productora (célula de insecto) es letal para esa célula en unos pocos días, obstaculizando la producción continua de la proteína recombinante de interés.

Zeng et al. (2007, Stem Cells 25: 1055-1061) divulgan una construcción de expresión de baculovirus que comprende 55 un gen de interés así como un gen de AAV rep78/68 y secuencias de ITR de AAV para la integración de la construcción en el sitio AAVS1 del genoma humano de células madre embrionarias humanas.

Sollerbrant et al. (2001, J. Gen. Virol. 82: 2051-2060) divulgan células HEK293 de mamífero, transfectadas con construcciones separadas de baculovirus que comprenden (i) un gen informador flanqueado por secuencias de ITR de AAV, (ii) un gen Rep de AAV, y (iii) un gen Cap de AAV, respectivamente, para la producción de vectores de rAAV.

Existe todavía, sin embargo, una necesidad en el estado de la técnica de niveles incrementados de producción de productos de gen de interés en células tales como las células de insectos.

Descripción de la invención Definiciones Según se utiliza en la presente memoria, el término “enlazado operativamente” se refiere a un enlace de elementos polinucleótidos (o polipéptidos) en una relación funcional. Un ácido nucleico está “enlazado operativamente” cuando está dispuesto en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de transcripción está enlazada operativamente con una secuencia de codificación si afecta a la transcripción de la secuencia de codificación. Enlazado operativamente significa que las secuencias de ADN que están enlazadas son típicamente contiguas y, cuando es necesario unir dos regiones de codificación de proteína, contiguas y en pauta de lectura.

“Secuencia de control de expresión” se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una secuencia de nucleótido a la que está operativamente enlazada. Una secuencia de control de expresión está “enlazada operativamente” a una secuencia de nucleótido cuando la secuencia de control de expresión controla y 15 regula la transcripción y/o la traducción de la secuencia de nucleótido. De ese modo, una secuencia de control de expresión puede incluir promotores, potenciadores, sitios de entrada de ribosoma interno (IRES) , terminadores de transcripción, un codón de inicio frente a un gen de codificación de proteína, señal de empalme para intrones, y codones de interrupción. El término “secuencia de control de expresión” se entiende que incluye, como mínimo, una secuencia cuya presencia está diseñada para influir en la expresión, y que puede incluir también componentes ventajosos adicionales. Por ejemplo, secuencias líder y secuencias de parejas de fusión son secuencias de control de expresión. El término puede incluir también el diseño de la secuencia de ácido nucleico de tal modo que los codones indeseables, de iniciación potencial dentro y fuera de la pauta, sean retirados de la secuencia. También puede incluir el diseño de la secuencia de ácido nucleico de tal modo que los sitios de empalme potencial indeseable sean eliminados. Esto incluye secuencias o secuencias de poliadenilación (pA) que dirigen la adición de una cola de poliA, es decir, una cadena de residuos de adenina en el extremo 3’ de un mARN, secuencias mencionadas como secuencias de poliA. También puede estar diseñada para potenciar la estabilidad del mARN. Secuencias de control de expresión que afectan a la estabilidad de transcripción y de traducción, por ejemplo promotores, así como secuencias que afectan a la traducción, por ejemplo secuencias de Kozak, son bien conocidas en células de insectos. Las secuencias de control de expresión pueden ser de una naturaleza tal que modulen la secuencia de nucleótido a la que están operativamente enlazadas de tal modo que se consigan niveles de expresión más bajos o niveles de expresión más altos.

Según se utiliza en la presente memoria, el término “promotor” o “secuencia reguladora de transcripción” se refiere a un fragmento de ácido nucleico que actúa para controlar la transcripción de una o más secuencias de codificación, y

que está situado corriente arriba con respecto a la dirección de transcripción del sitio de iniciación de transcripción de la secuencia de codificación, y que está identificado estructuralmente por la presencia de un sitio de enlace para polimerasa de ARN dependiente del ADN, sitios de iniciación de transcripción y otras secuencias de ADN incluyendo, aunque sin limitación,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para la producción de un producto de gen de interés, comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar una célula de insecto que comprende:

i) una primera casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica el producto de gen de interés que está operativamente enlazado a un promotor capacitado para activar expresión del producto de gen en la célula de insecto, y en el que la primera casete de expresión está flanqueada por cualquiera de los lados por secuencias de nucleótido de repetición terminal invertida (ITR) de virus adeno-asociado (AAV) ;

ii) al menos una segunda casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menos una proteína Rep de AAV que está operativamente enlazada a un promotor capacitado para activar expresión de las proteínas Rep en la célula de insecto;

b) cultivar la célula de insecto definida en a) bajo una condición que conduce a la expresión de la primera y la segunda casetes de expresión, y

c) opcionalmente, recuperar el producto de gen de interés, en el que la célula de insecto no comprende una proteína Cap parvoviral ni una secuencia de nucleótido que codifique una proteína Cap parvoviral, y en el que la primera y la segunda casetes de expresión están comprendidas en los mismos uno o dos vectores baculovirales separados.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la segunda casete de expresión comprende una pauta de lectura abierta que comprende secuencias de nucleótido que codifican al menos una de las proteínas Rep78 y Rep68.

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que la primera y la segunda casetes de expresión están presentes en una sola construcción, y en el que la construcción está flanqueada por al menos una secuencia de ITR de AAV.

4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el producto de gen es un polipéptido o un ácido nucleico.

5. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la primera casete de expresión no está integrada en el genoma de la célula.

6. Una célula de insecto que comprende:

i) una primera casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica un producto de gen de interés que está operativamente enlazado a un promotor capacitado para activar expresión del producto de gen en la célula de insecto, y en el que la primera casete de expresión está flanqueada por cualquiera de los lados por secuencias de nucleótido de ITR de AAV;

ii) al menos una segunda casete de expresión que comprende una secuencia de nucleótido que codifica al menos una proteína Rep de AAV que está operativamente enlazada a un promotor capacitado para activar expresión de las proteínas Rep en la célula de insecto,

en el que la célula no comprende una proteína Cap parvoviral ni una secuencia de nucleótido que codifique una proteína Cap parvoviral, en el que la primera y la segunda casetes de expresión están comprendidas en los mismos uno o dos vectores baculovirales separados, y en el que la célula no expresa al menos una de entre una proteína Rep 52 y una proteína Rep 40 parvovirales.

7. Una célula de insecto de acuerdo con la reivindicación 6, en la que la segunda casete de expresión comprende 55 una pauta de lectura abierta que comprende secuencias de nucleótido que codifican al menos una de las proteínas Rep78 y Rep68.

8. Una célula de insecto de acuerdo con la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en la que la primera y la segunda casetes de expresión están presentes en una construcción única, y en la que la construcción está flanqueada por al menos una secuencia de ITR de AAV.

9. Una célula de insecto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 – 8, en la que el producto de gen es un polipéptido o un ácido nucleico.

10. Una célula de insecto de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 6 – 9, en la que la primera casete de expresión no está integrada en el genoma de la célula.


 

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