Vectores de VAA mejorados producidos en células de insecto.

Una estructura artificial de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas de la cápsida VP1,

VP2 y VP3 de un virus adenoasociado (VAA), en donde el codón de iniciación para la traducción de la proteína de la cápsida VP1 de VAA se selecciona entre CTG, TTG y GTG y en donde la secuencia de nucleótidos está ligada funcionalmente a secuencias controladoras de la expresión para la expresión en una célula de insecto.

Vectores de VAA mejorados producidos en células de insecto.

Campo de la invención La presente invención se refiere a la producción de virus adenoasociados en células de insecto y a virus adenoasociados con una proporción alterada de las proteínas de la cápsida vírica que proporciona una infecciosidad mejorada.

Antecedentes de la invención El virus adenoasociado (VAA) se puede considerar como uno de los vectores víricos más prometedores para la terapia génica humana. El VAA tiene la capacidad de infectar eficazmente células humanas en división y que no se dividen, el genoma vírico de VAA se integra en un único sitio cromosómico en el genoma de la célula hospedadora y, lo más importante, aunque el VAA está presente en muchos seres humanos, nunca se ha asociado con ninguna enfermedad. De cara a estas ventajas, un virus adenoasociado recombinante (VAAr) está siendo evaluado en ensayos clínicos de terapia génica para la hemofilia B, el melanoma maligno, la fibrosis quística y otras enfermedades.

Las células hospedadoras que sustentan la replicación de VAA in vitro se obtienen todas ellas a partir de tipos celulares de mamíferos. Por lo tanto, VAAr para uso en la terapia génica ha sido producido hasta el momento principalmente en líneas celulares de mamífero, tales como por ejemplo, células 293, células COS, células HeLa, células KB y otras líneas celulares de mamífero (véanse, por ejemplo, los documentos de patentes US 6.156.303, US 5.387.484, US 5.741.683, US 5.691.176, US 5.688.676, US 20020081721, WO 00/47757, WO 00/24916 y WO 96/17947) . Los vectores de VAAr se producen típicamente en tales sistemas de cultivos celulares de mamífero, proporcionando plásmidos de ADN que contienen el gen terapéutico flanqueado por el origen de replicación de VAA (repeticiones terminales invertidas o RTIs) , genes para las proteínas de la replicación de VAA, Rep78, Rep68p Rep52 y Rep40, y genes para las proteínas del virión o estructurales VP1, VP2 y VP3. Además, se proporciona un plásmido que contiene genes tempranos procedentes de adenovirus (E2A, E4ORF6, VARNA) para mejorar la expresión de los genes de VAA y mejorar el rendimiento de los vectores (véase, por ejemplo, Grimm et al., 1998, Hum. Gene Ther. 9: 2745-2760) . Sin embargo, en la mayoría de estos sistemas de cultivo de células de mamíferos, el número de partículas de VAA generadas por célula es del orden de 104 partículas (revisado en Clark, 2002, Kidney Int. 61 (Supl. 1) : 9-15) . Para un estudio clínico, se pueden requerir más de 1015 partículas de VAAr. Para producir este número de partículas de VAAr, serían necesarios la transfección y el cultivo de aproximadamente 1011 células 293 humanas cultivadas, el equivalente a 5000 frascos de 175 cm2 de células, lo que significa la transfección de hasta 1011 células 293. Por lo tanto, la producción a gran escala de VAAr utilizando sistemas de cultivo de células de mamífero para obtener material para ensayos clínicos ya ha demostrado ser problemática, la producción a escala comercial puede ser incluso no factible. Además, existe siempre el riesgo de que un vector para uso clínico que se produce en un cultivo de células de mamífero se contamine con material no deseable, tal vez patógeno, presente en la célula hospedadora de mamífero.

Para resolver estos problemas de los sistemas de producción de mamíferos, se ha desarrollado recientemente un sistema de producción de VAA, utilizando células de insecto (Urabe et al., 2002, Hum. Gene Ther. 13: 1935-1943; documentos WO 03042361; US 20030148506 y US 20040197895) . Para la producción de VAA en células de insecto a partir del sistema de expresión de baculovirus, eran necesarias algunas modificaciones debido a que la expresión en células de mamífero de las tres proteínas de la cápsida de VAA (VP1, VP2 y VP3) con la estequiometría correcta depende de una combinación de uso alterno de dos sitios aceptores de corte y empalme y de la utilización subóptima de un codón de iniciación ACG para VP2, que no se puede reproducir con precisión en las células de insecto. La estequiometría correcta de las tres proteínas de la cápsida es importante para la infecciosidad de las partículas de VAA. Se sabe que las partículas de VAA que contienen cantidades reducidas de VP1 son menos infecciosas y que VP1 contiene actividad fosfolipasa A2 que tiene una función en la infecciosidad (Girod et al., 2002

J. Gen. Virol. 83: 973-8) .

Por lo tanto, para la expresión de las tres proteínas de la cápsida, Urabe et al. (2002, supra) utilizan una estructura artificial que se transcribe en un único mensajero policistrónico que es capaz de expresar las tres proteínas VP sin necesidad de corte y empalme. Para conseguir la producción de las tres proteínas de la cápsida con la estequiometría correcta, el marco de lectura de VP1, el primer codón iniciador que se observa a través del ribosoma de exploración, ha sido dotado con el codón iniciador subóptimo ACG y las secuencias en torno a este codón se han optimizado. Urabe et al. (2002, supra) describen que la exploración con ribosomas en células de insecto conduce a una estequiometría de las tres proteínas de la cápsida vírica que se aproxima a la de VAA de origen natural.

Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que en los vectores de VAA producidos en el sistema de baculovirus, VP1 todavía se expresa a un nivel subóptimo en relación con VP2 y que esto da como resultado una reducción de la infecciosidad en estudios in vitro e in vivo en ratones, en comparación, por ejemplo, con vectores de VAA convencionales, producidos en células 293 de mamífero. Por lo tanto, todavía existe una necesidad de un sistema de producción basado en baculovirus para vectores de VAAr con infecciosidad mejorada.

Compendio de la invención La invención, en su sentido más amplio, es como se caracteriza en las reivindicaciones adjuntas.

Descripción de la invención

Definiciones Tal y como se emplea en este documento, la expresión "ligado funcionalmente" se refiere a un ligamiento de elementos polinucleotídicos (o polipeptídicos) en una relación funcional. Un ácido nucleico está "ligado funcionalmente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, una secuencia reguladora de la transcripción está ligada funcionalmente a una secuencia codificadora si afecta a la transcripción de la secuencia codificadora. Ligado funcionalmente significa que las secuencias de ADN que se ligan son típicamente contiguas y, cuando proceda, unir dos regiones que codifican proteínas, contiguas y en fase de lectura.

"Secuencia controladora de la expresión" se refiere a una secuencia de ácido nucleico que regula la expresión de una secuencia de nucleótidos a la que está ligada funcionalmente. Una secuencia controladora de la expresión está "ligada funcionalmente" a una secuencia de nucleótidos cuando la secuencia controladora de la expresión controla y regula la transcripción y/o la traducción de la secuencia de nucleótidos. Por lo tanto, una secuencia controladora de la expresión puede incluir promotores, potenciadores, sitios internos de entrada al ribosoma (IRES) , terminadores de la transcripción, un codón de iniciación delante de un gen que codifica una proteína, señal de corte y empalme para intrones y codones de detención. La expresión "secuencia controladora de la expresión" incluye, como mínimo, una secuencia cuya presencia está diseñada para influir en la expresión, y también puede incluir componentes ventajosos adicionales. Por ejemplo, las secuencias líder y las secuencias de parejas de fusión son secuencias controladoras de la expresión. La expresión también puede incluir el diseño de la secuencia de ácido nucleico, de tal manera que codones potencialmente iniciadores, no deseables, en marco de lectura o fuera del marco, se eliminen de la secuencia. También puede incluir el diseño de la secuencia de ácido nucleico de tal manera que se eliminen sitios potenciales de corte y empalme no deseados. Incluye secuencias o secuencias de poliadenilación (pA) que dirigen la adición de una cola poliA, es decir, una cadena de residuos de adenina en el extremo 3' de un ARNm, secuencias denominadas secuencias poliA. También puede estar diseñada para mejorar la estabilidad del ARNm. Las secuencias controladoras de la expresión que afectan a la estabilidad de la transcripción y la traducción, por ejemplo, los promotores, así como secuencias que efectúan la traducción, por ejemplo, secuencias Kozak, son conocidas en las células de insecto. Las secuencias controladoras de la expresión pueden tener una naturaleza tal que modulen la secuencia de nucleótidos a la que están ligadas funcionalmente,... [Seguir leyendo]

1. Una estructura artificial de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3 de un virus adenoasociado (VAA) , en donde el codón de iniciación para la traducción de la proteína de la cápsida VP1 de VAA se selecciona entre CTG, TTG y GTG y en donde la secuencia de nucleótidos está ligada funcionalmente a secuencias controladoras de la expresión para la expresión en una célula de insecto.

2. Una estructura artificial de ácido nucleico según la reivindicación 1, en donde el codón de iniciación para la traducción de la proteína de la cápsida VP1 de VAA es CTG.

3. Una estructura artificial de ácido nucleico según la reivindicación 1 o 2, en donde la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia controladora de la expresión que comprende una secuencia de nueve nucleótidos de SEQ ID NO: 7 o una secuencia de nucleótidos sustancialmente homóloga a SEQ. ID NO: 7, antes del codón de iniciación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápsida VP1 de VAA.

4. Una estructura artificial de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótidos comprende una secuencia controladora de la expresión que comprende una secuencia de consenso Kozak alrededor del codón de iniciación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápsida VP1 de VAA, en donde la secuencia de consenso Kozak es GCCRCC NNN G (SEQ. ID NO: 8) , en donde R es una purina y en donde NNN representa un codón de iniciación subóptimo seleccionado entre CTG, TTG y GTG.

5. Una estructura artificial de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótidos comprende al menos una modificación de la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápsida VP1 de VAA seleccionada entre una G en la posición del nucleótido 12, una A en la posición del nucleótido 21 y una C en la posición del nucleótido 24.

6. Una estructura artificial de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la secuencia de nucleótidos está ligada funcionalmente a un promotor poliédrico.

7. Una estructura artificial de ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde la estructura artificial es un vector compatible con una célula de insecto, preferiblemente un vector de baculovirus.

8. Una célula de insecto que comprende una estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9. Una célula de insecto según la reivindicación 8, en donde la célula de insecto comprende adicionalmente:

(a) una segunda secuencia de nucleótidos que comprende al menos una secuencia de nucleótidos de una repetición terminal invertida (RTI) de VAA;

(b) una tercera secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora de Rep52 o Rep40 ligada funcionalmente a secuencias controladoras de la expresión, para la expresión en una célula de insecto; y

(c) una cuarta secuencia de nucleótidos que comprende una secuencia codificadora de Rep78 o Rep68 ligada funcionalmente a secuencias controladoras de la expresión, para la expresión en una célula de insecto.

10. Una célula de insecto según la reivindicación 9, en donde la célula de insecto comprende:

(a) una primera estructura artificial de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la primera estructura artificial de ácido nucleico comprende, además, las secuencias de nucleótidos tercera y cuarta tal y como se han definido en (b) y (c) de la reivindicación 9; y

(b) una segunda estructura artificial de ácido nucleico que comprende la segunda secuencia de nucleótidos tal y como se ha definido en (a) de la reivindicación 9.

11. Una célula de insecto según la reivindicación 10, en donde la segunda estructura artificial de ácido nucleico es un vector compatible con células de insecto, preferiblemente un vector de baculovirus.

12. Una célula de insecto según una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en donde la segunda secuencia de nucleótidos comprende adicionalmente al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico de interés preferentemente para la expresión en una célula de mamífero y en donde la secuencia de nucleótidos, al menos una, que codifica un producto génico de interés se incorpora en el genoma de un VAA producido en la célula de insecto.

13. Una célula de insecto según la reivindicación 12, en donde la segunda secuencia de nucleótidos comprende dos secuencias de nucleótidos de RTI de VAA y en donde la secuencia de nucleótidos, al menos una, que codifica un producto génico de interés se encuentra entre las dos secuencias de nucleótidos de RTI de VAA.

14. La célula de insecto según la reivindicación 9, en donde la primera secuencia de nucleótidos, la segunda secuencia de nucleótidos, la tercera secuencia de nucleótidos y la cuarta secuencia de nucleótidos se integran de forma estable en el genoma de la célula de insecto.

15. Un virión de VAA que comprende en su genoma al menos una secuencia de nucleótidos que codifica un

producto génico de interés, en donde la secuencia de nucleótidos, al menos una, no es una secuencia de nucleótidos de VAA natural, y en donde el virión de VAA comprende una proteína de la cápsida VP1 que comprende una leucina o una valina en la posición del aminoácido 1.

16. Un método para producir un VAA en una célula de insecto, que comprende las etapas de: (a) cultivar una célula de insecto tal y como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8-14 en condiciones tales que se 10 produzca VAA; y (b) recuperar el VAA.

17. Un método según la reivindicación 16, que comprende además la etapa de purificación por afinidad del VAA utilizando un anticuerpo anti-VAA, preferiblemente un anticuerpo inmovilizado.

18. Un método según la reivindicación 17, en el que el anticuerpo anti-VAA es un anticuerpo de camélido monocatenario o un fragmento del mismo.