Agentes terapéuticos de alanina-glioxilato aminotransferasa.

Agente terapéutico AGXT I340M para el uso como medicamento, donde el agente terapéutico AGXT I340M esseleccionado del grupo que consiste en:

a) una proteína AGXT I340M que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad desecuencia con SEC ID nº: 2 cuando está alineada óptimamente sobre su longitud total utilizando el programa GAP, y dondela proteína AGXT I340M comprende una metionina en una posición correspondiente a la posición 340 en SEC ID nº: 2;

b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M taly como se define en a); y,

c) un virión de un vector de terapia genética vírica que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se define enb).

Agentes terapéuticos de alanina-glioxilato aminotransferasa Campo de la invención [0001] La presente invención está en los campos de la medicina y la biología molecular. Más específicamente la invención se refiere a nuevos agentes terapéuticos de proteína y ácido nucleico basados en la alanina glioxilato aminotransferasa (AGXT) , en particular una variante de AGXT, incluyendo tratamientos asistidos por terapia genética, y métodos para el uso de estos agentes terapéuticos en el tratamiento y la prevención de condiciones causadas por la ausencia o deficiencia de alanina glioxilato aminotransferasa, incluyendo hiperoxaluria primaria de tipo I.

Antecedentes de la invención [0002] La hiperoxaluria primaria de tipo I (PH1) (OMIM #259900) es un trastorno metabólico raro, heredado en una manera recesiva autosómica. La PHI se caracteriza por una deficiencia de la enzima hepática alanina glioxilato aminotransferasa (AGXT o AGT; EC 2.6.1.44) , que está provocada normalmente por una mutación en el gen que codifica en 2q36-q37 (Genbank Acc. No. NM_000030, version 14 June 2008) . Una deficiencia de AGXT produce un fallo de detoxificación de glioxilato, con sobreproducción de oxalato. La AGXT convierte el glioxilato en glicina, utilizando alanina como donante del grupo amino, y el cofactor piridoxal-fosfato. Los niveles altos de oxalato en pacientes PHI se excretan por los riñones, que sufren un deterioro progresivo como resultado de la deposición de oxalato de calcio. Después del fallo renal, los niveles de oxalato se elevan hasta el punto de la oxalosis sistémica, una condición de amenaza para la vida. Habitualmente, el tratamiento más eficaz para la PH1 es el transplante de hígado preventivo o transplante conjunto de hígado y de riñón. No obstante, este tratamiento tiene sus propias limitaciones incluyendo el escaso suministro de órganos adecuados, morbilidad significativa y mortalidad, y exposición crónica a fármacos inmunosupresores.

Así, nuevos tratamientos para la PHI son necesarios. Es un objetivo de la presente invención el de proporcionar una proteína nueva y agentes terapéuticos de ácido nucleico basados en variantes de la alanina glioxilato aminotransferasa (AGXT) y métodos para el uso de estos agentes terapéuticos en el tratamiento y prevención de las condiciones provocadas por la ausencia o deficiencia de alanina glioxilato aminotransferasa, incluyendo hiperoxaluria primaria de tipo I.

Resumen de la invención [0004] La invención se refiere a un agente terapéutico de AGXT I340M, para el uso como medicamento o para el uso en un método de tratamiento. Tal terapéutico se puede utilizar en el tratamiento de una condición que responde a AGXT, por la cual, la condición que responde a AGXT es hiperoxaluria primaria de tipo I.

El agente terapéutico AGXT I340M se selecciona del grupo que consiste en: a) una proteína AGXT I340M que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 2 cuando se alinea óptimamente sobre su longitud total utilizando el programa GAP, y donde la proteína AGXT I340M comprende una metionina en la posición correspondiente a la posición 340 en la SEC ID nº: 2 b) una molécula de ácido nucleico que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M tal y como se define en a) ; y, c) un virión de un vector de terapia genética vírica que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se define en b) .

Un agente terapéutico AGXT basado en el tipo salvaje (no reivindicado) se puede definir de una forma similar al agente terapéutico AGXT I340M anteriormente descrito, excepto que tal agente terapéutico comprendería isoleucina (o un aminoácido diferente de la metionina) en una posición correspondiente a la posición 340 en la SEC ID nº: 2 (es decir, se puede basar en la secuencia de AGXT de tipo salvaje) . Aquí, lo que se describe en relación a un agente terapéutico AGXT I340M se puede aplicar de forma similar a un agente terapéutico AGXT basado en la secuencia de AGXT de tipo salvaje.

Un agente terapéutico AGXT I340M según la invención puede comprender además o codificar sustituciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en: a) una leucina en una posición correspondiente a la posición 11 en la SEC ID nº: 2 b) una arginina en una posición correspondiente a la posición 41 en la SEC ID nº: 2 c) una isoleucina en una posición correspondiente a la posición 152 en la SEC ID nº: 2 d) una arginina en una posición correspondiente a la posición 170 en la SEC ID nº: 2 e) una treonina en una posición correspondiente a la posición 244 en la SEC ID nº: 2 f) una treonina en una posición correspondiente a la posición 294 en la SEC ID nº: 2 g) una isoleucina en una posición correspondiente a la posición 326 en la SEC ID nº: 2 h) combinaciones de una o más de las sustituciones de aminoácidos b) a g) ; y, i) la combinación de las sustituciones a) y f) .

La invención también se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la proteína AGXT I340M de la invención, donde la secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un promotor para la expresión en células humanas y donde, opcionalmente, el promotor no es un promotor de un gen AGXT humano. Preferiblemente, el promotor es un promotor específico del hígado. El promotor específico del hígado se puede seleccionar del grupo que consiste en un promotor α1-anti-tripsina (AAT) , un promotor de globulina fijadora de hormona tiroidea, un promotor de albúmina, un promotor de globulina fijadora de tiroxina (TBG) , un promotor híbrido de la región de control hepática (HCR) -ApoCII, un promotor híbrido HCR-hAAT, un promotor AAT combinado con el elemento intensificador del gen de albúmina de ratón (Ealb) , un promotor de apolipoproteína E y un promotor que tiene la secuencia de SEC ID nº: 3. El constructo de ácidos nucleicos según este aspecto es preferiblemente un vector de terapia genética vírica, más preferiblemente un vector parvoviral.

La invención además concierne a un virión parvoviral que comprende un constructo de ácidos nucleicos que codifica el agente terapéutico AGXT I340M.

También, la invención se refiere a una composición farmacéutica que incluye un agente terapéutico AGXT, constructo de ácidos nucleicos o virión parvoviral de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona un método para el tratamiento de una condición que responde a AGXT donde el método comprende el paso de la administración de una cantidad eficaz del agente terapéutico AGXT I340M, un constructo de ácidos nucleicos, un virión parvoviral o una composición farmacéutica de la invención a un sujeto con dicha condición que responde a AGXT, por ejemplo, hiperoxaluria primaria de tipo I.

Además, la invención, proporciona el uso de un agente terapéutico AGXT I340M, un constructo de ácidos nucleicos, un virión parvoviral o una composición farmacéutica de la invención en la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de condiciones que responden a AGXT, por ejemplo, hiperoxaluria primaria de tipo I.

Descripción de las figuras [0013]

La Fig. 1 muestra un esquema de los vectores rAAV usados. Los vectores rAAV fueron construidos por inserción del ADNc humano de AGXT en un vector plásmido pro-AAV2, bajo el control de un promotor híbrido específico del hígado EalbAAT. Secuencia abajo del ADNc de AGXT (o GFP) se incluyó una señal de poliadenilación bGH. En algunos constructos se ha incluido un elemento regulador postranscripcional WPRE. El cassette de expresión fue flanqueado por repeticiones terminales invertidas de AAV2.

La Fig. 2 muestra excreción miccional de oxalato en ratones macho AGXT-/-tratados con etilenglicol (EG) después de la administración de 5x1012 gc/kg de vector terapéutico AA V8.Ealb-hAAT-AGXT-WPRE o vector de control AAV8.Ealb-hAAT- GFP-WPRE.

La Fig. 3a muestra el análisis de Western blot de la expresión de AGXT dentro de hígados de ratones AGXT-/- (de ambos géneros) 8 semanas después de la inyección intravenosa de 5x10e12 genomas de vector por kg vector AAV8 o AAV5 (éste último también administrado en una dosis diez veces inferior 5x10e11vg/kg) .

Figuras 3b y 3c (el inserto) muestran la expresión de AGT en las muestras de hígado de ratones macho AGXT-/inyectados con el AAV8.Ealb-hAAT-AGXT-WPRE o vector de control AAV8.Ealb-hAAT-GFP-WPRE (ampliación 100x) respectivamente.

La Fig. 3d muestra los resultados obtenidos por coloración immunohistoquímica de secciones de hígado congelado, con porcentajes de hepatocitos transducidos alrededor de 90%... [Seguir leyendo]

1. Agente terapéutico AGXT I340M para el uso como medicamento, donde el agente terapéutico AGXT I340M es seleccionado del grupo que consiste en:

a) una proteína AGXT I340M que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 2 cuando está alineada óptimamente sobre su longitud total utilizando el programa GAP, y donde la proteína AGXT I340M comprende una metionina en una posición correspondiente a la posición 340 en SEC ID nº: 2; b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M tal y como se define en a) ; y, c) un virión de un vector de terapia genética vírica que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se define en b) .

2. Agente terapéutico AGXT I340M para el uso en el tratamiento de la hiperoxaluria primaria de tipo I, donde el agente terapéutico AGXT I340M es seleccionado del grupo que consiste en:

a) una proteína AGXT I340M que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 2 cuando está alineada óptimamente sobre su longitud total utilizando el programa GAP, y donde la proteína AGXT I340M comprende una metionina en una posición correspondiente a la posición 340 en SEC ID nº: 2; b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M tal y como se define en a) ; y, c) un virión de un vector de terapia genética vírica que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se define en b) .

3. Uso de un agente terapéutico AGXT I340M para la producción de un medicamento para el tratamiento de la hiperoxaluria primaria de tipo I, donde el agente terapéutico AGXT I340M se selecciona del grupo que consiste en:

a) una proteína AGXT I340M que comprende una secuencia de aminoácidos con al menos un 90% de identidad de secuencia con SEC ID nº: 2 cuando está alineada óptimamente sobre su longitud total utilizando el programa GAP, y donde la proteína AGXT I340M comprende una metionina en una posición correspondiente a la posición 340 en SEC ID nº: 2; b) una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M tal y como se define en a) ; y, c) un virión de un vector de terapia genética vírica que comprende una molécula de ácido nucleico tal y como se define en b) .

4. Agente terapéutico AGXT I340M para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un uso según la reivindicación 3, donde la proteína AGXT I340M comprende sustituciones de aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en:

a) una leucina en una posición correspondiente a la posición I en SEC ID nº: 2; b) una arginina en una posición correspondiente a la posición 41 en SEC ID nº: 2; c) una isoleucina en una posición correspondiente a la posición 152 en SEC ID nº: 2; d) una arginina en una posición correspondiente a la posición 170 en SEC ID nº: 2; e) una treonina en una posición correspondiente a la posición 244 en SEC ID nº: 2; f) una treonina en una posición correspondiente a la posición 294 en SEC ID nº: 2; g) una isoleucina en una posición correspondiente a la posición 326 en SEC ID nº: 2 h) combinaciones de una o más de las sustituciones de aminoácidos b) a g) ; y, i) la combinación de las sustituciones a) y f) .

5. Agente terapéutico AGXT I340M para el uso según la reivindicación 1 o reivindicación 2 o un uso según la reivindicación 3, donde la proteína AGXT I340M se selecciona del grupo que consiste en:

a) una proteína AGXT I340M comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2 y, b) una proteína AGXT I340M comprendiendo la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº: 2 y que comprende una o más sustituciones de aminoácidos tal y como se define en la reivindicación 4.

6. Agente terapéutico AGXT I340M para el uso según la reivindicación 1 o la reivindicación 2 o un uso según la reivindicación 3, donde el agente terapéutico AGXT I340M es una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M tal y como se define en la reivindicación 4 o 5.

7. Constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína AGXT I340M tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde la secuencia de nucleótidos está enlazada operativamente a un promotor para la expresión en células humanas y, opcionalmente, donde el promotor no es un promotor de un gen AGXT humano.

8. Construcción de ácido nucleico según la reivindicación 7, donde el promotor es un promotor específico del hígado.

9. Constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 8, donde el promotor específico del hígado se selecciona del grupo que consiste en un promotor α1-anti-tr y psin (AAT) , un promotor de globulina fijadora de hormona tiroidea, un promotor de albúmina, un promotor de globulina fijadora de tiroxina (TBG) , un promotor híbrido de la región de control hepática (HCR) -ApoCII, un promotor híbrido HCR-hAAT, un promotor AAT promotor combinado con el elemento intensificador del gen de albúmina de ratón (Ealb) y un promotor de apolipoproteína E.

10. Constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 7, donde el promotor tiene la secuencia de SEC ID nº: 3.

11. Constructo de ácidos nucleicos según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde el constructo es un vector de terapia genética vírica, preferiblemente un vector parvoviral.

12. Virión parvoviral que comprende un constructo de ácidos nucleicos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11.

13. Composición farmacéutica que incluye un agente terapéutico AGXT I340M para el uso tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un constructo de ácidos nucleicos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11 o un virión parvoviral tal y como se define en la reivindicación 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.

14. Constructo de ácidos nucleicos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, un virión parvoviral tal y como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica tal y como se define en la reivindicación 13 para el uso en el tratamiento de la hiperoxaluria primaria de tipo I.

15. Uso de un constructo de ácidos nucleicos tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, un virión parvoviral tal y como se define en la reivindicación 12 o una composición farmacéutica tal y como se define en la reivindicación 13 en la producción de un medicamento para el uso en el tratamiento de hiperoxaluria primaria de tipo I.