Uso de fusiones de proteína/péptido de transtiretina para aumentar la semivida sérica de péptidos/proteínas farmacológicamente activos.

Un polipéptido de transtiretina (TTR) que comprende la secuencia aminoacídica que se expone en la SEQ IDNO:

1, que comprende una sustitución en la posición de cisteína a alanina.

Uso de fusiones de proteína/péptido de transtiretina para aumentar la semivida sérica de péptidos/proteínas farmacológicamente activos Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud de EE.UU. nº 10/117.109, presentada el 4 de abril de 2002.

Antecedentes de la invención Las proteínas, péptidos y otras moléculas farmacológicas para uso terapéutico están actualmente disponibles en formas adecuadas y en cantidades suficientes en gran medida como resultado de los avances en las tecnologías de ADN recombinante. La disponibilidad de dichos péptidos y proteínas ha generado avances en la formulación y modificación química de proteínas. La modificación química de péptidos, proteínas, oligonucleótidos y otros fármacos biológicamente activos con fines de alargar la semivida sérica de dichos agentes bioactivos se ha estudiado extensamente. La capacidad de alargar la semivida sérica de dichos agentes permite alcanzar el potencial terapéutico del agente sin necesidad de altas dosificaciones y una administración frecuente.

La modificación química usada para alargar las semividas de proteínas in vivo incluye la conjugación química de un polímero hidrosoluble, tal como polietilenglicol (PEG) , con la proteína de interés. Se han usado una variedad de enfoques para ligar las moléculas de polietilenglicol con la proteína (PEGilación) . Por ejemplo, Royer (patente de EE.UU. nº 4.002.531) afirma que se usó alquilación reductora para el ligamiento de moléculas de polietilenglicol con una enzima. Davis et al. (patente de EE.UU. nº 4.179.337) dan a conocer conjugados de PEG:proteína que implican, por ejemplo, enzimas e insulina. Shaw (patente de EE.UU. nº 4.904.584) da a conocer la modificación del número de residuos de lisina en proteínas para el ligamiento de moléculas de polietilenglicol mediante grupos amina reactivos. Hakimi et al. (patente de EE.UU. nº 5.834.594) dan a conocer conjugados de PEG:proteína hidrosolubles sustancialmente no inmunogénicos que implican, por ejemplo, las proteínas IL-2, interferón α e IL-1ra. Los métodos de Hakimi et al. implican el uso de ligadores únicos para conectar los diversos grupos amino libres en la proteína con el PEG. Kinstler et al. (patentes de EE.UU. nº 5.824.784 y 5.985.265) enseñan métodos que permiten proteínas modificadas químicamente en el extremo N de forma selectiva y análogos de las mismas, incluyendo G-CSF e interferón de consenso.

Otros enfoques diseñados para alargar la semivida sérica de agentes bioactivos incluyen: la conjugación del péptido con una proteína grande estable que sea demasiado grande para filtrarse a través de los riñones (por ejemplo, seroalbúmina) ; G. D. Mao et al., Biomat., Art. Cells, Art. Org. 17: 229-244 (1989) ; el uso de lipoproteínas de baja y alta densidad como vehículos de transporte y para aumentar la semivida sérica; P. Chris de Smidt et al., Nuc. Acids. Res., 19 (17) : 4695-4700 (1991) ; el uso de la región Fc de inmunoglobulinas para producir fusiones de Fc-proteína; documento PCT WO 98/28427 (Mann et aI., y las referencias citadas en el mismo) ; y el uso del dominio Fc para aumentar la semivida in vivo de uno o más péptidos biológicamente activos; documento PCT WO 00/24782 (Feige et aI., y las referencias citadas en el mismo) .

La transtiretina (TTR) (anteriormente denominada prealbúmina) es una proteína sérica tetramérica de 56 kDa que desempeña papeles fisiológicos importantes como transportador de tiroxina y proteína de unión a retinol; Hamilton y Benson, Cell. Mol. Life Sci., 58: 1491-1521 (2001) y las referencias citadas en el mismo. Blaney et al., en la patente de EE.UU. nº 5.714.142, describen la explotación de TTR al dotar al fármaco a administrar de una funcionalidad que le permita unirse específicamente a la proteína. Específicamente, Blaney et al. demuestran que el ligamiento covalente de un péptido, proteína, nucleótido, oligonucleótido, oligosacárido u otro fármaco con un ligando selectivo de transtiretina unirá reversiblemente el fármaco con la TTR y aumentará así la semivida sérica del agente basándose en la afinidad del ligando por TTR. Se afirma que la actividad intrínseca del fármaco no se altera de forma adversa y que el conjugado de fármaco-ligando de TTR resultante seguirá siendo suficientemente pequeño para absorción oral.

Compendio de la invención

La invención se expone en las reivindicaciones.

Se ha encontrado sorprendentemente y de forma importante que la TTR (o una variante de TTR) , y en particular una TTR o variante de TTR que se ha modificado químicamente mediante conjugación con un polímero hidrosoluble, puede usarse, por ejemplo, como copartícipe de fusión con un agente biológicamente activo para aumentar la semivida sérica del agente biológicamente activo. Por consiguiente, la presente invención proporciona un medio para aumentar la semivida sérica de un agente biológicamente activo seleccionado.

La presente invención se refiere por tanto a preparaciones sustancialmente homogéneas de fusiones de TTR (o una variante de TTR) -agente biológicamente activo y fusiones de PEG-TTR (PEG-variante de TTR) -agente biológicamente activo. En comparación con el agente biológicamente activo solo, la fusión de TTR-agente biológicamente activo y/o fusión de PEG-TTR-agente biológicamente activo tiene una semivida sérica sustancialmente aumentada.

La presente invención se refiere adicionalmente a fusiones de TTR-agente biológicamente activo y fusiones de PEGTTR-agente biológicamente activo en un portador farmacéuticamente aceptable que proporcionan un compuesto farmacológicamente activo.

Se describe la preparación de variantes de TTR. Específicamente, se modifican las proteínas TTR de tal modo que se introducen por ingeniería genética un residuo o residuos de cisteína en la secuencia de proteína TTR. Las variantes de TTR son recuperables con alto rendimiento y se modifican químicamente entonces mediante conjugación con un polímero hidrosoluble en el residuo de cisteína, proporcionando una variante de TTR químicamente modificada que puede fusionarse entonces con un agente biológicamente activo seleccionado.

Se describen procesos para preparar compuestos farmacológicamente activos. Por ejemplo, el método para preparar una preparación sustancialmente homogénea de una fusión de PEG-TTR-péptido comprende: (a) introducir por ingeniería genética un residuo de cisteína en una posición aminoacídica específica de la secuencia aminoacídica de dicha TTR, proporcionando una variante de dicha TTR; (b) conjugar un polietilenglicol con dicha variante de TTR en dicho residuo de cisteína, proporcionando una PEG-TTR; (c) fusionar dicha PEG-TTR con un péptido de interés, proporcionando una fusión de PEG-TTR-péptido y (d) aislar dicha fusión de PEG-TTR-péptido.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 es un gel de SDS que exhibe la purificación de una variante de transtiretina (TTR) humana recombinante expresada en E. coli (C10A/GB3C) con un péptido bradicinina fusionado con el extremo C de la TTR. El carril 1 contiene los patrones de peso molecular Novex Mark 12 y los carriles 2-7 contienen respectivamente lo siguiente: lisado celular, sobrenadante postcalentamiento, agrupamiento de la etapa de cromatografía con Q-Sepharose, agrupamiento de la etapa de cromatografía con fenil-Sepharose, agrupamiento de la etapa de cromatografía con hidroxiapatito y agrupamiento de la etapa de cromatografía con Source Q.

La Figura 2 demuestra mediante cromatografía de exclusión por tamaño que la fusión de péptidos con el extremo amino o extremo carboxilo de una variante de TTR, TTR (C10A/G83C) , no altera su estructura oligomérica. La línea continua es TTR (C10A/G83C) , la línea de trazos es hormona paratiroidea (PTH) fusionada con el extremo amino de TTR (C10A/G83C) y la línea de puntos es bradicinina fusionada con el extremo carboxilo de TTR (C10A/G83C) .

La Figura 3 demuestra mediante cromatografía de exclusión por tamaño que la fusión de proteínas con el extremo amino o extremo carboxilo de una variante de TTR, TTR (C10A) , no altera su estructura oligomérica. La línea continua es TTR (C10A) , la línea de trazos es IL-1ra fusionada con el extremo carboxilo de TTR (C10A) y la línea de puntos es IL-1ra fusionada con el extremo amino de TTR (C10A) .

La Figura 4 muestra la unión observada usando BIAcore de diversos constructos de TPO-péptido mimético (TMP) con receptor de MPL humano: ■ Fc-TMP, ● TMP (m) -TTR, ▲ TMP (m) -TTR-PEG 5K, ▼ TMP (m) -TTR-PEG 20K.

La Figura 5 muestra que la inyección de TMP (m) -TTR-PEG 5K induce la formación de plaquetas en ratones. Los siguientes símbolos corresponden... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido de transtiretina (TTR) que comprende la secuencia aminoacídica que se expone en la SEQ ID NO: 1, que comprende una sustitución en la posición 10 de cisteína a alanina.

2. El polipéptido de TTR de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la sustitución de la alanina en la posición 37 por cisteína.

3. El polipéptido de TTR de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la sustitución del ácido aspártico en posición 38 por cisteína.

4. El polipéptido de TTR de la reivindicación 1 que comprende adicionalmente la sustitución de la alanina en posición 81 por cisteína.

5. El polipéptido de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la sustitución de la glicina en posición 83 por cisteína.

6. El polipéptido de TTR de la reivindicación 2 o la reivindicación 5, que comprende adicionalmente la sustitución de la lisina en posición 15 por alanina.

7. El polipéptido de TTR de la reivindicación 1, en el que el polipéptido de TTR se modifica químicamente con un producto químico seleccionado del grupo consistente en dextrano, poli (n-vinilpirrolidona) , polietilenglicoles, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli (óxido de propileno) /óxido de etileno, polioles polietoxilados y polivinilalcoholes.

8. El polipéptido de TTR de la reivindicación 7, en el que el polipéptido de TTR está modificado químicamente con polietilenglicol (PEG) .

9. El polipéptido de TTR de la reivindicación 8, en el que el PEG tiene un peso molecular de entre 1 kDa y 100 kDa, incluyendo entre 5 kDa y 30 kDa.

10. Una proteína de fusión que comprende una proteína fusionada con el polipéptido de TTR de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

11. Un ácido nucleico aislado que codifica el polipéptido de TTR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

12. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido de TTR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.

13. Una célula hospedadora que comprende el vector de expresión de la reivindicación 12.