Terapia bacteriolítica de combinación para el tratamiento de tumores.

Uso de esporas de una bacteria Clostridium novyi bacteriológicamente pura,

aislada y defectuosa paratoxinas o una bacteria Clostridium sordellii bacteriológicamente pura, aislada y defectuosa para toxinas enla fabricación de un medicamento para tratar tumores en un mamífero, mediante el cual el tumorexperimenta una remisión o su crecimiento se ralentiza o se detiene.

Terapia bacteriolítica de combinación para el tratamiento de tumores

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

Esta invención se refiere al campo de la oncología. En particular se refiere a tratamientos biológicos y químicos combinados de tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

A pesar el enorme progreso en la comprensión de la fisiopatología de la neoplasia, formas avanzadas de cáncer siguen siendo resistentes al tratamiento.

Aunque la base de este fallo es compleja, un motivo es que la mayoría de los tumores contienen zonas grandes, escasamente vascularizadas, que limitan la eficacia de la radiación y fármacos quimioterápicos (Jain, 1994) (Jain, 2001) . Las regiones escasamente vascularizadas son menos sensibles a la radiación ionizante porque sus efectos destructores de células dependen del oxígeno; son menos sensibles a los fármacos quimioterápicos porque la entrega de fármacos a estas regiones es obviamente inferior a la óptima. Como el agente terapéutico contra el cáncer no debe dejar agrupaciones significativas de células viables dentro de cada lesión para conseguir un efecto clínicamente significativo, las regiones escasamente vascularizadas de los tumores representan un obstáculo importante para un tratamiento eficaz.

Uno de los desarrollos recientes más importantes en la biología de los tumores es el reconocimiento de que la neoangiogénesis es esencial para el crecimiento de tumores hasta tamaños clínicamente significativos. Lo que se ha reconocido menos ampliamente es que esta neoangiogénesis a menudo no es proporcional al crecimiento de las células neoplásicas, dando como resultado zonas necróticas grandes compuestas de células muertas o que se están muriendo. Por ejemplo, se ha encontrado que una de cada 20 metástasis de hígado seleccionadas aleatoriamente con un tamaño > 1 cm3 contenían regiones relativamente grandes de necrosis/apoptosis, que constituían en general del 25% al 75% de la masa tumoral (figura 1) . Las células adyacentes a estas zonas necróticas están escasamente vascularizadas y es probable que sean difíciles de tratar con agentes convencionales.

Se ha reconocido durante medio siglo que las bacterias anaerobias pueden proliferar de manera selectiva en las regiones hipóxicas de los tumores (Parker, 1947) (Malmgren, 1955) (Mose, 1963) (Gericke, 1963) (Thiele, 1963) (Carey, 1967) (Kohwi, 1978) (Brown, 1998) (Fox, 1996) (Lemmon, 1997) (Sznol, 2000) (Low, 1999) (Clairmont, 2000) (Yazawa, 2000) (Yazawa, 2001) (Kimura, 1980) . Se han ideado estrategias ingeniosas para aprovechar potencialmente tales bacterias con fines de diagnóstico y terapéuticos, aunque recientemente se ha hecho relativamente poco trabajo en esta área.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Una realización de la invención proporciona el uso de esporas de una bacteria Clostridium novyi bacteriológicamente pura, aislada y defectuosa para toxinas o una bacteria Clostridium sordellii bacteriológicamente pura, aislada y defectuosa para toxinas en la fabricación de un medicamento para tratar tumores en un mamífero, mediante el cual el tumor experimenta una remisión o su crecimiento se ralentiza o se detiene. Opcionalmente, también se incluye un agente antitumoral en dicho medicamento. El tumor experimenta una remisión o su crecimiento se ralentiza o se detiene como resultado de estas administraciones.

Otra realización de la invención proporciona un kit para tratar tumores. Los componentes del kit están en un recipiente dividido o no dividido. Los componentes incluyen esporas de una bacteria Clostridium novyi defectuosa para toxinas o una bacteria Clostridium sordellii defectuosa para toxinas y un agente que colapsa la vasculatura tumoral.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Figura 1. Metástasis colorrectales típicas en seres humanos. Zonas extensas de necrosis, indicadas con flechas, están entremezcladas con zonas de células tumorales viables. Se observaron zonas grandes de necrosis similares en cada una de las lesiones metastásicas de 20 pacientes diferentes elegidos al azar de los archivos patológicos.

Figuras 2A-2D. Distribución de bacterias anaerobias dentro de los tumores. A ratones que presentaban tumores B16 subcutáneos se les inyectaron por vía intravenosa a través de la vena de la cola 5 x 107 bacterias B. longum vivas o esporas de C. novyi de tipo natural. A los ratones con B. longum se les proporcionó una inyección intraperitoneal con lactulosa diariamente durante cinco días para aumentar el crecimiento bacteriano (Yazawa, 2000) y entonces se sacrificaron para analizar la colonización tumoral. Los ratones con C. novyi se sacrificaron el día tras la inyección para su análisis. Las tinciones de Gram revelaron que un gran número de bacterias B. longum se habían concentrado dentro de unas pocas colonias, mientras que C. novyi se había dispersado por todas las partes escasamente vascularizadas de los tumores. (Figura 2A, figura 2B) Vista de alto y bajo aumento de un experimento con B. longum representativo, que muestra las bacterias (teñidas de azul intenso) agrupadas dentro de una colonia. (Figura 2C) Experimento con C novyi, que muestra la dispersión de las bacterias por toda la región necrótica del tumor. (Figura 2D) Vista de alto aumento, que muestra la invasión de bacterias C. novyi al interior de células tumorales viables circundantes (teñidas de morado) a la izquierda.

Figura 3. Eliminación del gen de toxina letal de C. novyi. Tras un choque térmico, se realizó una PCR en ADN de colonias para identificar aquéllas que habían perdido el gen de toxina letal en el episoma de fago. La electroforesis en gel de agarosa de los productos de PCR con dos conjuntos de cebadores independientes (ToxA y ToxB) muestra un clon de C. novyi (C. novyi-NT) que había perdido el gen y un clon (C. novyi) que lo conservaba. Se proporcionaron controles mediante conjuntos de cebadores (PlcA y PlcB) específicos para el gen de fosfolipasa C de C. novyi que demuestran la integridad de los moldes de ADN en todas las reacciones.

Figura 4A-4D. Distribución de bacterias C. novyi-NT tras la inyección intravenosa de esporas. (Figura 4A) Tinción con H y E de un xenoinjerto de tumor HCT116 típico de un ratón al que no se le habían inyectado las bacterias, que muestra algo de necrosis. (Figura 4B) Tinción con H y E de un tumor 24 horas tras la inyección intravenosa de 5 x 107 esporas de C. novyi-NT. (Figura 4C) Tinción de Gram, que revela bacterias distribuidas por toda la región necrótica. (Figura 4D) Vista de alto aumento, que muestra un lecho de bacterias en la superficie de contacto entre las regiones viables y necróticas del tumor en la parte superior e inferior de la imagen, respectivamente.

Figuras 5A-5B. Necrosis hemorrágica tras COBALT. (Fig 5A) Ratón que presenta tumor HCT116 24 horas tras la inyección i.v. con 5 x 107 esporas de C. novyi-NT. Se observa una ligera hinchazón asociada con edema en el sitio tumoral. Entonces se administró por vía intravenosa D10 (0, 3 mg/kg) (momento=0) , y seguido 24 horas después por MMC (4 mg/kg) . Resulta evidente un punto negro que indica necrosis hemorrágica cerca del centro del tumor a los 0, 3 días. La zona de necrosis hemorrágica se expandió gradualmente a lo largo del día siguiente. Entonces bajó la hinchazón en el sitio tumoral y la masa tumoral necrótica y la piel que la rodeaba se contrajo y se disolvió gradualmente (días 6 a 30) . (Figura 5B) Ratones típicos cinco semanas tras el tratamiento con una dosis única de D10 más MMC (parte superior) o con una dosis única de COBALT (parte inferior) . De los ocho ratones tratados con COBALT en este experimento, cuatro se habían curado aparentemente de su tumor, ya que no se observó recidiva tras tres meses de observación.

Figuras 6A-6C. Cuantificación de los efectos de COBALT. (Figura 6A) Se hicieron crecer células de cáncer colorrectal HCT116 como xenoinjertos en ratones desnudos. Cuando los tumores tenían un tamaño de ~700 mm3, se les inyectaron a los animales por vía intravenosa 5 x 107 esporas de C. novyi-NT (momento 0) , seguido por la inyección i.v. de D10 (0, 3 mg/kg) a las 24 horas y la inyección i.p. de MMC (4 mg/kg) a las 48 horas. A los grupos control no se les administró tratamiento o se les trató con D10 más MMC sin esporas. Cada grupo consistía en de seis a diez ratones. Se sacrificaron los animales cuando sus tumores superaban el 15% de su peso corporal. En el experimento mostrado, siete de ocho ratones tratados con una dosis única de COBALT desarrollaron una necrosis hemorrágica notable de sus tumores en el plazo de 24 horas tras la administración de D10. Cuatro de estos siete ratones se curaron, mientras que tres de los ratones murieron tres días tras el tratamiento,... [Seguir leyendo]

1. Uso de esporas de una bacteria Clostridium novyi bacteriológicamente pura, aislada y defectuosa para toxinas o una bacteria Clostridium sordellii bacteriológicamente pura, aislada y defectuosa para toxinas en la fabricación de un medicamento para tratar tumores en un mamífero, mediante el cual el tumor experimenta una remisión o su crecimiento se ralentiza o se detiene.

2. Uso de esporas de una bacteria Clostridium novyi o una bacteria Clostridium sordellii, en las que está delecionado un gen de toxina de una forma de tipo natural de la bacteria, y un agente antitumoral, en la fabricación de un medicamento para tratar tumores en un mamífero, mediante el cual el tumor experimenta una remisión o su crecimiento se ralentiza o se detiene.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el medicamento es para administración intravenosa de las esporas.

4. Uso según la reivindicación 2, en el que el medicamento es para administración intratumoral de las esporas.

5. Uso según la reivindicación 2, en el que el agente antitumoral es radiación.

6. Uso según la reivindicación 2, en el que el agente antitumoral es un anticuerpo.

7. Uso según la reivindicación 2, en el que el agente antitumoral colapsa la vasculatura tumoral.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el agente antitumoral es colchicina.

9. Uso según la reivindicación 7, en el que el agente antitumoral es dolastatina-10.

10. Uso según la reivindicación 7, en el que el agente antitumoral es ácido 5, 6-dimetilxantenon-4-acético.

11. Uso según la reivindicación 7, en el que el medicamento comprende además un fármaco quimioterápico que daña el ADN.

12. Uso según la reivindicación 11, en el que el fármaco quimioterápico que daña el ADN es mitomicina C.

13. Uso según la reivindicación 11, en el que el fármaco quimioterápico que daña el ADN es citoxano.

14. Uso según la reivindicación 2, en el que el medicamento es para administración en serie de las esporas y el agente antitumoral.

15. Uso según la reivindicación 11, en el que el medicamento es para administración en serie de las esporas, el agente antitumoral y el fármaco quimioterápico que daña el ADN.

16. Uso de esporas de una bacteria Clostridium novyi que es defectuosa para toxinas y dolastatina-10 en la fabricación de un medicamento para tratar tumores en un mamífero, en el que el medicamento es para administración intravenosa de las esporas, y mediante el cual el tumor experimenta una remisión o su crecimiento se ralentiza o se detiene.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que el medicamento comprende además citoxano.

18. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 7 y 11, en el que el medicamento comprende además: alopurinol.

19. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 7 y 11, en el que el mamífero está hidratado.

20. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 7 y 11, en el que el medicamento comprende: urato oxidasa.

21. Uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 11, en el que el medicamento comprende además un agente esteroideo.

22. Uso según la reivindicación 21, en el que el agente esteroideo es prednisona.

23. Uso según la reivindicación 7 o la reivindicación 11, en el que el medicamento comprende además G-CSF.

24. Kit para su uso en el tratamiento de tumores, en el que los componentes del kit están en un recipiente dividido o no dividido, comprendiendo dichos componentes:

esporas de una bacteria Clostridium novyi defectuosa para toxinas o una bacteria Clostridium sordellii defectuosa para toxinas; y un agente que colapsa la vasculatura tumoral.

25. Kit para su uso según la reivindicación 24, en el que un gen de toxina de una forma de tipo natural de bacteria Clostridium novyi o Clostridium sordellii está delecionado en las esporas de la bacteria anaerobia.

26. Kit para su uso según la reivindicación 24, que comprende además un fármaco quimioterápico que daña el ADN.

27. Kit para su uso según la reivindicación 24, en el que el agente es colchicina.

28. Kit para su uso según la reivindicación 24, en el que el agente es dolastatina-10.

29. Kit para su uso según la reivindicación 24, en el que el agente es ácido 5, 6-dimetilxantenon-4-acético.

30. Kit para su uso según la reivindicación 26, en el que el fármaco quimioterápico que daña el ADN es mitomicina C.

31. Kit para su uso según la reivindicación 26, en el que el fármaco quimioterápico que daña el ADN es citoxano.

32. Kit para su uso en el tratamiento de tumores, en el que los componentes del kit están en un recipiente dividido o no dividido, comprendiendo dichos componentes: esporas de bacterias Clostridium novyi que son defectuosas para toxinas;

dolastatina-10; y citoxano.