Técnicas y composiciones de detección y evaluación de la transducción intracelular de una señal extracelular.

SE MUESTRA LA TRANSCRIPCION BASADA EN ENSAYOS QUE IDENTIFICAN SEÑALES EXTRACELULARES QUE MODULAN LA ACTIVIDAD DE PROTEINAS DE LA SUPERFICIE CELULAR.

LAS SEÑALES CELULARES SE IDENTIFICAN MEDIANTE LA MEDICION DE LA CANTIDAD DE TRANSCRIPCION DE UN GEN INFORMANTE EN UNA CELULA RECOMBINANTE QUE EXPRESA LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR Y CONTIENE DNA CODIFICANDO AL GEN INFORMANTE BAJO EL CONTROL TRANSCRIPCIONAL DE UN PROMOTOR QUE ES REGULADO, DIRECTA O INDIRECTAMENTE, POR LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR. LOS ENSAYOS PROPORCIONAN UN MEDIO PARA IDENTIFICAR COMPUESTOS FARMACEUTICOS POTENCIALES QUE PUEDEN SER USADOS PARA TRATAR ENFERMEDADES EN VIRTUD DE SUS EFECTOS AGONISTAS O ANTAGONISTAS SOBRE LA PROTEINA DE LA SUPERFICIE CELULAR. TAMBIEN SE PROPORCIONAN LAS CELULAS RECOMBINANTES QUE EXPRESAN RECEPTORES EN LA SUPERFICIE CELULAR Y QUE CONTIENEN CONSTRUCCIONES DEL GEL INFORMANTE QUE INCLUYEN ELEMENTOS REGULADORES TRANSCRIPCIONALES QUE SON RESPONSABLES DE LA ACTIVIDAD DE LOS RECEPTORES DE LASUPERFICIE CELULAR.

Técnicas y composiciones de detección y evaluación de la transducción intracelular de una señal extracelular

Esta invención se relaciona con métodos de identificación y evaluación de las propiedades farmacológicas de compuestos que modulan las actividades de las proteínas de la superficie celular, a saber, de los receptores acoplados a proteína G. Esta invención se relaciona también con ensayos que valoran la transducción intracelular de una señal extracelular usando células recombinantes que se modifican por introducción de un gen informador bajo el control de un promotor regulable y que expresan proteínas de la superficie celular cuyas actividades están moduladas por la señal extracelular y cuyas actividades indirecta o directamente regulan la expresión del promotor.

En particular, esta invención se relaciona con métodos para detectar y valorar la capacidad de substancias para actuar como agonistas o antagonistas de la actividad de receptores específicos localizados en la superficie celular, a saber, de receptores acoplados a proteína G.

Los organismos eucarióticos están compuestos por una multitud de células, tejidos y órganos que deben reaccionar rápidamente y de un modo concertado a los estímulos ambientales, incluyendo estímulos externos e internos, y a los estímulos intercelulares e intracelulares. Para que los organismos eucarióticos lo hagan, se han desarrollado mecanismos y rutas bioquímicas para conseguir respuestas rápidas y concertadas. Las proteínas de la superficie celular que se extienden por la membrana celular proporcionan un medio para conseguir estas respuestas.

Las proteínas de la superficie celular permiten la transducción intracelular de señales extracelulares. Las proteínas de la superficie celular proporcionan a las células eucarióticas, así como a las procarióticas, un medio para detectar señales extracelulares y transducir dichas señales intracelularmente de un modo que da como resultado en último lugar una respuesta celular o una respuesta tisular u orgánica concertada. Las proteínas de la superficie celular, transmitiendo intracelularmente información concerniente al ambiente extracelular a través de rutas intracelulares específicas, inducen una respuesta apropiada a un estímulo particular. La respuesta puede ser inmediata y transitoria, lenta y mantenida, o alguna mezcla de éstas. En virtud de una serie de proteínas de superficie de membrana variadas, las células eucarióticas son exquisitamente sensibles a su ambiente.

Las moléculas de señales extracelulares, tales como las hormonas del crecimiento, los vasodilatadores y los neurotransmisores, ejercen sus efectos, al menos en parte, a través de la interacción con las proteínas de la superficie celular. Por ejemplo, algunas moléculas de señales extracelulares causan cambios en la transcripción de genes diana mediante cambios en los niveles de segundos mensajeros, tales como el AMPc. Otras señales alteran indirectamente la expresión génica activando la expresión de genes, tales como los genes inmediatos-precoces que codifican para proteínas reguladoras, que a su vez activan la expresión de otros genes que codifican para proteínas reguladoras de la transcripción. Por ejemplo, la expresión de genes neuronales está modulada por numerosas señales extracelulares, incluyendo los neurotransmisores y la actividad eléctrica de la membrana. Las señales trans-sinápticas causan respuestas rápidas en neuronas, que se producen a lo largo de un período de tiempo que varía entre milisegundos, tales como la apertura de canales abiertos por ligandos, y segundos y minutos, tales como los fenómenos mediados por segundos mensajeros. Los genes en células neurales que responden a la estimulación trans-sináptica y a la actividad eléctrica de la membrana incluyen genes, llamados genes inmediatos-precoces, cuya transcripción se activa rápidamente en cuestión de minutos y de forma transitoria (véase, por ejemplo, Sheng et al. (1990) , Neuron 4: 477-485) y genes cuya expresión requiere síntesis de proteínas y cuya expresión es inducida o 45 alterada en el transcurso de horas.

Los receptores y los canales iónicos de la superficie celular están entre las proteínas de la superficie celular que responden a señales extracelulares e inician los sucesos que conducen a esta variada expresión génica y respuesta. Los canales iónicos y los receptores localizados en la superficie celular son proteínas de la membrana de la superficie celular ubicuas y fisiológicamente importantes. Tienen un papel central en la regulación de los niveles intracelulares de diversos iones y agentes químicos, muchos de los cuales son importantes para la viabilidad y función de la célula.

Canales iónicos 55 Los canales iónicos, que aparecen en una amplia variedad de organismos, incluidos los hongos, las plantas y los animales, son proteínas que se extienden por la membrana y que permiten la entrada controlada de diversos iones en las células desde el fluido extracelular. Funcionan como poros con compuerta en la membrana celular y permiten el flujo de iones en gradientes eléctricos o químicos. Los canales iónicos se clasifican en base al ion que entra en la célula a través del canal.

Canales iónicos abiertos por voltaje La modulación del transporte iónico de transmembrana es con frecuencia el fenómeno primario en el acoplamiento 65 de las señales extracelulares a los fenómenos intracelulares. Los flujos iónicos tienen papeles esenciales en el estímulo-secreción, el estímulo-mitosis y el estímulo-contracción (véase Curran et al. (1986) , Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 83: 8521-8524) . Por ejemplo, la apertura por voltaje de los iones calcio media en el acoplamiento de los estímulos despolarizantes de la membrana a la activación transcripcional del gen c-fos. La elevación del calcio intracelular activa un sistema de calmodulina/calmodulina quinasa que induce la expresión de c-fos.

Canales de sodio Los canales de sodio son responsables de la fase de elevación del potencial de acción en células excitables. Los canales de sodio sienten el campo eléctrico de transmembrana y responden abriendo un canal iónico de transmembrana con especificidad por el Na+.

Los canales de sodio han sido estudiados y están bien caracterizados. Se han clonado los genes codificantes del canal del sodio, que es una glicoproteína, a partir de numerosas fuentes y se han usado para expresar corrientes de sodio dependientes del voltaje cuando se inyectan en oocitos de Xenopus (véase Noda et al. (1986) , Nature 322: 826-828) .

Canales de calcio Los canales de calcio son proteínas de múltiples subunidades que se extienden por la membrana y que permiten la entrada controlada de iones Ca+2 en las células desde el fluido extracelular. Todas las células a través de todo el reino animal, y al menos algunas células bacterianas, fúngicas y vegetales, poseen uno o más tipos de canales de calcio.

El tipo más común de canal de calcio es dependiente del voltaje. En un canal dependiente del voltaje, la “apertura” para permitir que se inicie un influjo de iones Ca+2 hacia el interior de las células requiere una despolarización a un cierto nivel de la diferencia de potencial entre el interior de la célula portadora del canal y el ambiente extracelular. La velocidad de influjo de Ca+2 hacia el interior celular depende de esta diferencia de potencial. Todas las células “excitables” de animales, tales como las neuronas del sistema nervioso central, las células de los nervios periféricos y las células musculares, incluyendo las de los músculos esqueléticos, las de los músculos cardíacos y las de los músculos lisos venosos y arteriales, tienen canales de calcio dependientes del voltaje. Se piensa que los canales de calcio dependientes del voltaje consisten en dos grandes subunidades, de entre aproximadamente 130 y aproximadamente 200 kilodaltons (“kD”) de peso molecular, y una serie (generalmente se piensa que de una a tres) de diferentes subunidades más pequeñas, de menos de aproximadamente 60 kD de peso molecular. Al menos una de las subunidades mayores y posiblemente algunas de las menores están glicosiladas. Algunas de las subunidades son capaces de fosforilarse.

Los canales de Ca2+ dependientes del voltaje regulan la función celular en células excitables en muchos tejidos, incluyendo el cerebro y las células musculares. En las células excitables, estos canales de calcio median en la despolarización dependiente de calcio y traducen los cambios en el potencial de membrana en una señal de calcio intracelular que inicia funciones celulares específicas.

Los antagonistas del calcio bloquean el flujo a través de los canales del... [Seguir leyendo]

1. Un método de estudio de compuestos de ensayo para determinar la actividad agonista o antagonista de cada uno de dichos compuestos con respecto a un receptor acoplado a proteínas G de la superficie celular, consistente en las 5 siguientes etapas:

a) poner en contacto una célula eucariótica que contiene un receptor acoplado a proteínas G heterólogo expresado a partir de un gen heterólogo y una construcción de gen informador heterólogo con el compuesto, donde la construcción de gen informador contiene un gen informador bajo el control de al menos un elemento de control de la transcripción que responde a una condición intracelular que se produce cuando dicho receptor interacciona con el compuesto, y b) medir la cantidad de transcripción o de traducción del gen informador. c) comparar la diferencia en la cantidad de transcripción o de traducción de un gen informador en una célula eucariótica en presencia del compuesto de ensayo con la cantidad de transcripción o de traducción en ausencia de compuesto, o con la cantidad de transcripción en ausencia del receptor acoplado a proteínas G, mediante lo cual se identifican los compuestos de ensayo que modulan dicha actividad mediada por receptores.

2. El método de la reivindicación 1, donde la construcción de gen informador contiene una secuencia reguladora de la transcripción que es el elemento regulador intragénico del gen c-fos, mediante lo cual el nivel de transcripción del

gen informador en ausencia del receptor de la superficie celular o del compuesto de ensayo es menor que en ausencia del elemento regulador intragénico.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el receptor acoplado a proteínas G es seleccionado entre receptores muscarínicos y receptores adrenérgicos. 25

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el elemento de control transcripcional incluye un promotor seleccionado entre: el promotor del gen c-fos, el promotor del gen del péptido intestinal vasoactivo, el promotor del gen de la somatostatina, el promotor del gen de la proencefalina, el promotor del gen de la fosfoenol-piruvato carboxiquinasa o el promotor del gen del factor de crecimiento de los nervios-1 A.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el gen informador es seleccionado entre el gen codificante de la cloranfenicol acetiltransferasa bacteriana, el gen codificante de la luciferasa de luciérnaga, el gen codificante de la β-galactosidasa o el gen codificante de la fosfatasa alcalina.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la construcción del gen informador incluye al menos una secuencia de nucleótidos reguladora de la transcripción seleccionada entre elementos que responden al suero, elementos que responden al monofosfato cíclico de adenosina y elementos que responden a los niveles intracelulares de iones calcio.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde se determina la cantidad de transcripción midiendo la cantidad de ARNm que se transcribe a partir del gen informador.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde se mide la cantidad de transcripción o de traducción midiendo la cantidad de proteína del gen informador que se produce. 45

9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el compuesto de ensayo es un antagonista.

10. El método de la reivindicación 9, que además consiste, antes de comparar la diferencia en la cantidad de

transcripción o de traducción del gen informador, en poner en contacto la célula eucariótica con un agonista que 50 activa el receptor acoplado a proteínas G, mediante lo cual se induce la transcripción del gen informador.

11. Un método de la reivindicación 1, donde el ensayo es un rastreo de un gran número de compuestos potencialmente efectivos desde el punto de vista farmacéutico.