Procedimiento de selección de levaduras enológicas.

Un procedimiento de selección de levaduras enológicas de la especie Saccharomyces cerevisiae en función de almenos un carácter enológico,

caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- se identifica un locus asociado a un carácter enológico de interés, ligado a la producción de fenolesvolátiles;

- se identifica un alelo adecuado de dicho locus, asociado a la ausencia de producción de fenoles volátiles,estando caracterizado dicho alelo adecuado por un polimorfismo de secuencia con el gen PAD1 sobre labase 638 de dicho gen PAD1, siendo dicho polimorfismo una mutación de la adenina en guanina quesupone la conversión del ácido aspártico en glicina en la posición 213 de la proteína;

- se prepara un marcador molecular capaz de detectar el alelo adecuado de dicho locus;

- se criban levaduras enológicas de la especie Saccharomyces cerevisiae con el marcador molecular con elfin de seleccionar las levaduras que tienen dicho alelo adecuado y por lo tanto el carácter enológico deinterés.

Procedimiento de seleccion de levaduras enologicas Campo tecnico La invencion se refiere a un procedimiento de seleccion de levaduras enologicas de la especie Saccharomyces cerevisiae destinadas a ser utilizadas en el campo agroalimentario. Con mas precision, la invencion se refiere a un procedimiento que permite seleccionar de manera rapida y segura las levaduras en funcion de los caracteres particulares buscados. La invencion propone mas particularmente seleccionar las levaduras enologicas en funcion de un caracter enologico ligado a la produccion de fenoles volatiles, y llegado el caso en funcion de otros caracteres enologicos particulares, tales como la capacidad de fermentacion de las levaduras y/o las propiedades olfativas, gustativas, visuales, de conservacion etc. que se desean conferir a un vino.

Estado de la tecnica Las levaduras intervienen en numerosos procesos de elaboracion de productos alimentarios destinados al consumo animal, humano y no humano. Por ejemplo, las levaduras de fermentacion se utilizan para la fabricacion del pan, de la cerveza, del vino etc. Es conocido ahora utilizar levaduras particulares para elaborar tales productos alimentarios, de manera que influyan sobre el proceso de fabricacion y/o sobre las propiedades organolepticas del producto terminado.

En lo que se refiere mas particularmente al vino, el aroma del vino es de una gran complejidad en razon de los constituyentes volatiles que le componen. A lo largo de las diferentes etapas bioquimicas y tecnologicas de la vinificacion, el mosto de uva, con sabor relativamente neutro, se transforma en una bebida alcoholica extremadamente rica desde el punto de vista organoleptico. Las levaduras de fermentacion tales como las levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae, tienen un impacto nada despreciable sobre la formacion del aroma del vino. A lo largo de la fermentacion alcoholica, tres categorias de moleculas olorosas son producidas por la levadura: los aromas de fermentacion, los olores anormales y los aromas varietales.

Los aromas de fermentacion son las moleculas procedentes del metabolismo de los azucares y de los aminoacidos. Ellas participan en la calificacion general del vino.

Los olores anormales estan especialmente ligados a la produccion de sulfuro de hidrogeno, que presenta un olor nauseabundo a huevos podridos. Su produccion resulta de la reduccion de los sulfatos y los sulfitos presentes en el mosto de uva, e implica el complejo enzimatico de la sulfito-reductasa. Se sabe que para evitar la superproduccion de sulfuro de hidrogeno, hay que aplazar algunos dias la fecha de sulfitado del vino despues de la fermentacion alcoholica.

Los olores anormales estan igualmente ligados a la surproduccion de acidos volatiles tales como el acido acetico, que se acumulan en el vino a lo largo de las diferentes etapas de vinificacion.

Los aromas varietales, especificos de las cepas son igualmente responsables de la tipicidad del vino. Algunos entre ellos, que pertenecen a la categoria de los tioles, son revelados por las levaduras a partir de precursores inodoros y no volatiles contenidos en el mosto. Se ha demostrado que ciertas cepas de levaduras revelan mejor que otras el potencial aromatico contenido en el mosto de uva.

Los comportamientos de fermentacion de las levaduras enologicas, es decir sus capacidades para alcanzar rapidamente una fermentacion alcoholica, son dependientes de tres factores principales: la asimilacion del sustrato nitrogenado, la asimilacion de los azucares fermentables y la tolerancia al etanol.

Las levaduras enologicas presentan una variabilidad genetica importante que lleva consigo una fuerte variabilidad metabolica que influye en estos diferentes parametros durante el procedimiento de vinificacion. Esta fuerte variabilidad se explica por un grado elevado de polimorfismo genetico. La mayoria de las veces, los caracteres tecnologicos de las levaduras se reparten de manera cuantitativa en el seno de una poblacion. Esta distribucion traduce la influencia de varias regiones del genoma (locus) que comprenden uno o varios genes de interes. En el seno de una poblacion, estos genes presentan variaciones de secuencias (denominadas alelos) de las cuales algunas aportan una ventaja tecnologica particular. La mayoria de las veces estas regiones geneticas no estan mas que groseramente localizadas, se denominan normalmente QTL por « Quantitative Trait Loci » (locus de un caracter cuantitativo) , (Lynch & Walsh 1998) .

Actualmente, es conocido seleccionar las levaduras enologicas en funcion de sus caracteres enologicos, o aptitudes tecnologicas ligadas al vino, mediante cribado fenotipico de colecciones de levaduras. Esta metodologia presenta como principal defecto la necesidad de efectuar ensayos tecnologicos sobre importantes poblaciones. Este enfoque reduce fuertemente los plazos de seleccion y en consecuencia el tamafo de la poblacion analizada. Cuando se

desean varios caracteres tecnologicos, se realizan clasicamente programas de cruce y se seleccionan los mejores individuos. Segun el grado de complejidad de los programas de cruce (hibridacion, segregacion de F1, retrocruzamiento...) y el numero de parametros a matriciar, el tamafo de las muestras a analizar genera muy rapidamente programas de seleccion demasiado largos y demasiado costosos. Ademas, no es posible con este metodo seccionar a priori las levaduras enologicas que comprenden ciertos alelos adecuados ya conocidos que intervienen en uno o varios caracteres enologicos.

Exposicion de la invencion Tambien, en la invencion, se busca proporcionar un metodo de seleccion rapido y eficaz de levaduras enologicas de la especie Saccharomyces cerevisiae que puedan presentar un caracter enologico ligado a la produccion de fenoles volatiles, y segun el caso tambien uno o varios caracteres enologicos de interes diferentes. En la invencion, se busca igualmente obtener una cepa de levaduras que presenta un fondo genetico interesante desde un punto de vista vinicola y un alelo adecuado que interviene en un caracter enologico especifico ligado a la produccion de fenoles volatiles y del que la cepa de levaduras esta inicialmente desprovista.

Para esto, la invencion propone proceder a una seleccion de levaduras enologicas de la especie Saccharomyces cerevisiae que presenten dicho caracter enologico interesante previamente asociado a un locus especifico, con la ayuda de marcadores moleculares capaces de identificar un alelo adecuado de dicho locus. Un marcador molecular es un punto del genoma que presenta polimorfismos de secuencia (alelos) entre varios individuos. Las tecnicas de tipificacion molecular permiten identificar este alelo y conocer rapidamente el genotipo de numerosos individuos. Los marcadores moleculares se pueden obtener a partir de multiples metodos tales como la PCR/RFLP, DHLPC, hibridacion de sondas especificas marcadas, los microsatelites, los chips de ADN etc. Deuna manera general, se entiende por tipificacion molecular todo metodo de biologia molecular capaz de detectar una variacion de secuencia de ADN y/o de ARN y/o peptidica entre dos individuos. Los marcadores moleculares en cuestion pueden o bien identificar directamente la variacion de secuencia responsable del caracter enologico, o bien estar localizados en una posicion cercana a esta Segun la invencion, se puede introducir igualmente por introgresion en un fondo genetico elegido, un locus asociado a un caracter enologico de interes, ligado a la produccion de fenoles volatiles, donde un alelo adecuado proviene de una cepa donadora, y proceder a una seleccion de los descendientes que presentan dicho alelo adecuado con la ayuda de marcadores moleculares. La introgresion consiste en una introduccion progresiva de al menos un locus de interes de una cepa de levadura donadora en el genoma de otra cepa de levadura mediante una sucesion de hibridaciones y de cruzamientos a cambio.

La invencion tiene por tanto por objeto un procedimiento de seleccion de levaduras enologicas de la especie Saccharomyces cerevisiae, tal como se define en la reivindicacion 1. En modos de realizacion particulares, el procedimiento responde a una o varias de las caracteristicas de las reivindicaciones 2 a 11.

Por seleccion, se entiende la identificacion y el aislamiento de las levaduras enologicas, es decir de las levaduras que intervienen en el proceso de fabricacion del vino, especialmente en el proceso de fermentacion. En el campo de la enologia, se utilizan principalmente las levaduras del genero Saccharomyces y en particular de la especie Saccharomyces cerevisiae.

Por caracter enologico, se entiende asimismo tanto un caracter ligado a las propiedades organolepticas finales del vino como un caracter que interviene en el proceso de fabricacion del vino. El caracter enologico de interes puede asi... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de seleccion de levaduras enologicas de la especie Saccharomyces cerevisiae en funcion de al menos un caracter enologico, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-se identifica un locus asociado a un caracter enologico de interes, ligado a la produccion de fenoles volatiles;

-se identifica un alelo adecuado de dicho locus, asociado a la ausencia de produccion de fenoles volatiles, estando caracterizado dicho alelo adecuado por un polimorfismo de secuencia con el gen PAD1 sobre la base 638 de dicho gen PAD1, siendo dicho polimorfismo una mutacion de la adenina en guanina que supone la conversion del acido aspartico en glicina en la posicion 213 de la proteina;

- se prepara un marcador molecular capaz de detectar el alelo adecuado de dicho locus;

-se criban levaduras enologicas de la especie Saccharomyces cerevisiae con el marcador molecular con el fin de seleccionar las levaduras que tienen dicho alelo adecuado y por lo tanto el caracter enologico de interes.

2. Un procedimiento de seleccion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

-se amplifica un fragmento de ADN genomico de las levaduras por la reaccion de polimerizacion en cadena (PCR) por medio de un cebador de secuencia SEQ 1D Nquot; 8 y de un cebador de secuencia SEQ 1D Nquot; 9;

- se somete dicho fragmento a una digestion enzimatica por la enzima de restriccion Bg11;

-se seleccionan las levaduras caracterizadas por la presencia de un corte por la enzima Bg11, teniendo dichas levaduras dicho alelo adecuado.

3. Un procedimiento de seleccion de levaduras enologicas segun una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque dicho alelo adecuado tiene la secuencia SEQ 1D Nquot;7.

4. Un procedimiento de seleccion segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

- se selecciona una cepa de levadura elite;

- se selecciona con la ayuda de marcadores moleculares una cepa de levaduras donadoras que presenta al menos un alelo adecuado asociado al caracter enologico de interes,

- se introduce por introgresion el alelo adecuado en los descendientes de la cepa de levadura elite

- se seleccionan con la ayuda de marcadores moleculares los descendientes de la cepa de levadura elite que presentan el alelo adecuado.

5. Un procedimiento de seleccion segun la reivindicacion 4, caracterizado porque al menos un alelo adecuado introducido en la cepa de levadura elite tiene la secuencia SEQ 1D Nquot;7.

6. Un procedimiento de seleccion segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el alelo adecuado esta presente en forma de homocigoto en las levaduras seleccionadas.

7. Un procedimiento de seleccion segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el alelo adecuado esta presente en forma de heterocigoto en las levaduras seleccionadas.

8. Un procedimiento de seleccion segun una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque comprende la siguiente etapa:

- se seleccionan las levaduras enologicas que presentan un alelo segun la SEQ 1D Nquot;4, teniendo dichas levaduras seleccionadas mejores caracteristicas para la produccion de sulfuro de hidrogeno.

9. Un procedimiento de seleccion segun una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque comprende la siguiente etapa:

- se seleccionan las levaduras enologicas que presentan un alelo segun la SEQ 1D Nquot;19 y/o la SEQ 1D Nquot;16, teniendo dichas levaduras seleccionadas mejores caracteristicas con respecto al contenido en azucares residuales al final de la fermentacion alcoholica.

10. Un procedimiento de seleccion segun una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque comprende la siguiente etapa:

-se seleccionan las levaduras enologicas que presentan un alelo segun la SEQ 1D Nquot;10 y/o la SEQ 1D

Nquot;13, teniendo dichas levaduras seleccionadas mejores caracteristicas con respecto al tiempo para liberar 5 el 80 % de C02.

11. Un procedimiento de seleccion segun una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque comprende la siguiente etapa::

-se seleccionan las levaduras enologicas que presentan un alelo segun la SEQ 1D Nquot;1, teniendo dichas levaduras seleccionadas mejores caracteristicas con respecto a la velocidad relativa a la semi

fermentacion, a la duracion de la fermentacion y al contenido de azucares residuales al final de la fermentacion alcoholica.

12. Una secuencia nucleotidica que tiene la secuencia nucleotidica de la SEQ 1D Nquot;7.

13. Una cepa de levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae obtenida por un procedimiento segun la reivindicacion 4, que no produce fenoles volatiles.