Polimorfismos del promotor del factor inhibidor de la migración de macrófagos en la enfermedad inflamatoria.

Un procedimiento de diagnóstico in vitro de la existencia o de la predisposición a la artritis reumatoide,

quecomprende detectar 5, 6, 7 u 8 unidades de repetición del tetranucleótido CATT entre las posiciones -817 y -785 del gende MIF humano, usando el conjunto de cebadores de amplificación de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 1 ySEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 8, oSEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12, en el que la presencia de una unidad de repetición del tetranucleótido CATT 5,5homocigótica indica la existencia o la predisposición a una gravedad baja de la enfermedad, y en el que la ausencia deuna unidad de repetición del tetranucleótido CATT 5,5 homocigótica indica la existencia o la predisposición a unagravedad alta de la enfermedad.

Polimorfismo del promotor del factor inhibidor de la migración de macrófagos en la enfermedad inflamatoria

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención Esta invención se refiere a un procedimiento y aparato de diagnóstico basado en un polimorfismo funcional en el promotor de un gen que codifica el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) . Más específicamente, esta invención se refiere a un procedimiento para diagnosticar la predisposición a determinados estados patológicos, mediante la detección de la presencia de este polimorfismo del promotor. La invención también se refiere al aparato para detectar el polimorfismo, genes del MIF que contienen el polimorfismo y a una sonda para ello.

Antecedentes de la tecnología Una serie de estudios experimentales han conducido al concepto de que el factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF) funciona como un contrarregulador fisiológico de la acción glucocorticoide en el sistema inmunitario. En esta función, la posición del MIF en la cascada de citoquinas es actuar en coordinación con los glucocorticoides endógenos para controlar el nivel de referencia y la magnitud de la respuesta inflamatoria (1) . El MIF también tiene varias funciones proinflamatorias directas en enfermedades inflamatorias tales como la artritis reumatoide (2) , sepsia (3, 4) , síndrome de dificultad respiratoria aguda (5) y glomerulonefritis (6) .

El MIF se describió originalmente hace unos 30 años como un factor derivado de linfocitos T que inhibía la migración de macrófagos peritoneales (7) , pero ahora se sabe que varios otros tipos de células, incluyendo los propios macrófagos, son fuentes importantes de MIF (8) . Los niveles de MIF son elevados en el suero y en el líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (2, 9) , y en las diartrosis la inmunotinción de MIF se puede localizar en los macrófagos CD14+ del revestimiento sinovial y sinoviocitos de tipo fibroblastos (2) . Después de la liberación, MIF es directamente proinflamatorio por activación o promoción de la expresión de citoquinas (TNFa (8, 10) , IL-11, IL-2 (11) , IL-6 (8, 12) , IL-8

(13) e IFNy (11, 14) ) , liberación de óxido nítrico (15) , expresión de metaloproteinasas de la matriz (MMP) (16, 17) , e inducción de la ruta de la ciclooxigenasa-2 (Cox-2) (18) . La capacidad de MIF para inducir la activación sostenida de la ruta de la MAP quinasa p44/p42 (ERK-1/2) (18) e inhibir la apoptosis dependiente de p53 (19, 20) , también sugiere que este mediador tiene una función importante en el inicio del paño sinovial reumatoide.

La patente de EE. UU. nº 6.030.615 de Bucala y col., describe un procedimiento de combinación para tratar enfermedades causadas por la toxicidad mediada por citoquinas, que comprende administrar una cantidad eficaz de (a) un inhibidor de MIF, tal como un anticuerpo que se une a un polipéptido MIF, en el que el polipéptido MIF tiene un peso molecular de aproximadamente 12, 5 kDa en combinación con (b) anticuerpo dirigido contra TNFa, dirigido contra IL1, dirigido contra IFN-y, IL-1RA, un esteroide, un glucocorticoide o IL10.

El concepto de que los polimorfismos en los genes de respuesta inmunitaria contribuyen a la patogénesis de determinadas enfermedades autoinmunitarias/inflamatorias humanas ha recibido un interés creciente en los últimos años. Actualmente, se han mostrado muy pocos polimorfismos génicos que sean funcionalmente importantes y que tengan un valor en el pronóstico en estados patológicos específicos. Los ejemplos previamente definidos incluyen polimorfismos en TNFa e IL1ra que se ha mostrado que tienen cierta importancia en el pronóstico de la malaria y la cardiopatía isquémica, respectivamente (24, 25) . Igualmente, se ha publicado que una serie de polimorfismos en el TNFa y la IL-1 están asociados con la gravedad de la artritis reumatoide (26-28) .

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se basa en parte en la identificación de un nuevo polimorfismo en el gen Mif humano que consiste en una repetición del tetranucleótido CATT situada en la posición -817 del promotor de Mif. Como se describe en el presente documento, este polimorfismo del promotor es funcionalmente significativo in vitro, y el análisis de una cohorte de pacientes con artritis reumatoide indica que esta repetición CATT está asociada con la gravedad de la enfermedad.

Por lo tanto, un objeto de esta invención es proporcionar un procedimiento de diagnóstico que comprende determinar el genotipo de un promotor de Mif humano.

Otro objeto de esta invención, es proporcionar medios de diagnóstico que comprenden un medio para determinar el genotipo de un promotor de Mif humano.

Por consiguiente, la invención se refiere a un procedimiento de diagnostico de la gravedad de una enfermedad inflamatoria no infecciosa o de una predisposición a la gravedad de una enfermedad inflamatoria no infecciosa, que comprende detectar un polimorfismo en un promotor de Mif humano que se correlaciona con un aumento o disminución de la expresión del polipéptido MIF. En este procedimiento, la enfermedad inflamatoria no infecciosa es, por ejemplo, autoinmunidad, enfermedad de injerto contra huésped, o preferiblemente artritis reumatoide, y preferiblemente la detección del polimorfismo es indicativa de la gravedad de la enfermedad o la predisposición a la gravedad de la

enfermedad. Preferiblemente, este polimorfismo en un promotor de Mif humano que se correlaciona con un aumento o disminución de la expresión del polipéptido MIF es un polimorfismo de repetición del tetranucleótido CATT en la posición -817 del gen Mif humano, seleccionado del grupo que consiste en 5, 6, 7 y 8 unidades de repetición, donde la presencia de 5 unidades de repetición indica la aparición o predisposición a la gravedad baja de la enfermedad.

El procedimiento de diagnóstico de la invención comprende preferiblemente una etapa de amplificación del promotor de Mif usando una técnica de PCR. Para este propósito, la invención proporciona un conjunto de cebadores de PCR seleccionados para amplificar una región de un promotor de Mif humano. Por ejemplo, el conjunto de cebadores de la PCR se puede seleccionar del grupo que consiste en: (i) MIF-F (-1024) y MIF-R (-421) ; (ii) MIF-F (-441) y MIF-R (+4) ;

(iii) MIF-F (-13) y MIF-R (+395) ; y (iv) MIF-F (+379) y MIF-R (+1043) , como se muestra en la tabla 1, más adelante. La invención también se refiere a un procedimiento de uso de un conjunto de cebadores de la invención para detectar un polimorfismo en una región del promotor de Mif humano, y a un artículo de fabricación (tal como un kit de diagnóstico) que comprende un conjunto de cebadores de PCR de la invención.

La invención se refiere además a una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia del promotor de Mif humano en la que el tetranucleótido CATT en la posición -817 se repite 5, 6, 7 u 8 veces. Preferiblemente, la molécula de ácido nucleico es una molécula de ADN aislada, en particular un fragmento de ADN genómico aislado, que se ha amplificado a partir de una muestra de ADN de un sujeto humano. En realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una parte de un promotor de Mif humano que comprende un polimorfismo de repetición del tetranucleótido CATT en la posición -817 del gen Mif humano.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un procedimiento de terapia de la enfermedad inflamatoria que comprende detectar en un individuo la gravedad de una enfermedad inflamatoria no infecciosa o una predisposición a la gravedad de una enfermedad inflamatoria no infecciosa. Este procedimiento comprende: detectar en un sujeto humano un polimorfismo en un promotor de Mif humano que se correlaciona con un aumento o disminución en la expresión del polipéptido MIF, donde la detección del polimorfismo es indicativa de la gravedad de la enfermedad o la predisposición a la gravedad de la enfermedad. Este procedimiento de terapia de la enfermedad inflamatoria comprende además tratar al sujeto humano para prevenir o reducir la gravedad de la enfermedad inflamatoria o retrasar el inicio de la enfermedad inflamatoria. Por ejemplo, la terapia puede comprender tratar al sujeto humano administrando una cantidad eficaz de al menos un agente seleccionado del grupo que consiste en un inhibidor del MIF, un anticuerpo dirigido contra el TNF-a, un anticuerpo dirigido contra la IL1, y un anticuerpo dirigido contra el IFN-y, IL-1RA, un esteroide, un glucocorticoide y IL-10.

En una realización preferida del procedimiento de la invención de terapia de la enfermedad inflamatoria, la enfermedad inflamatoria es la artritis reumatoide y el polimorfismo en un... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de diagnóstico in vitro de la existencia o de la predisposición a la artritis reumatoide, que comprende detectar 5, 6, 7 u 8 unidades de repetición del tetranucleótido CATT entre las posiciones -817 y -785 del gen de MIF humano, usando el conjunto de cebadores de amplificación de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 1 y

SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12, en el que la presencia de una unidad de repetición del tetranucleótido CATT 5, 5 homocigótica indica la existencia o la predisposición a una gravedad baja de la enfermedad, y en el que la ausencia de una unidad de repetición del tetranucleótido CATT 5, 5 homocigótica indica la existencia o la predisposición a una gravedad alta de la enfermedad.

2. Un procedimiento de detección in vitro de la gravedad de la artritis reumatoide, que comprende detectar la presencia o ausencia de una unidad de repetición del tetranucleótido CATT 5, 5 homocigótica entre las posiciones -817 y -785 del gen de MIF humano, usando el conjunto de cebadores de amplificación de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12, en el que la presencia de una unidad de repetición del

tetranucleótido CATT 5, 5 homocigótica está asociada con un riesgo menor de artritis grave, y en el que la ausencia de una unidad de repetición del tetranucleótido CATT 5, 5 homocigótica está asociada con un riesgo mayor de artritis grave.

3. Uso de un conjunto de cebadores para amplificar una región del promotor de MIF humano, en el que el tetranucleótido CATT en la posición -817 se repite 5 veces, 6 veces, 7 veces u 8 veces.

4. Uso según la reivindicación 3, en el que se usa uno de los siguientes conjuntos de cebadores: SEQ ID NO: 1 y

SEQ ID NO: 2, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 9, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 8, o SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 12.