Nuevo proceso para la purificación altamente selectiva de dos proteínas plasmáticas: factor de von willebrand (vwf) y fibronectina (fn).

Proceso para la producción secuencial de dos proteínas, el vWF y la Fn,

partiendo de una fracción biológicaenriquecida en vWF y en Fn, caracterizado por una única purificación cromatográfica con una resina de intercambioaniónico fuerte.

Nuevo proceso para la purificación altamente selectiva de dos proteínas plasmáticas: factor de von willebrand (vwf) y fibronectina (fn) 5

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere al ámbito de la purificación de proteínas de plasma humano.

Estado de la técnica

El Factor de von Willebrand (vWF) es una de las mayores glucoproteínas conocidas que circulan en el plasma. Esta proteína está en forma de multímeros, que se mantienen unidos por puentes de disulfuro, cuyo peso molecular puede variar desde 260 KDa (subunidad base) hasta 20 millones de Daltons.

El vWF es muy importante en el proceso hemostático; de hecho, además de realizar su función como portador y estabilizador del FVIII en la sangre, es esencial para la adhesión de los trombocitos al endotelio/subendotelio dañado. En la primera etapa de la hemostasia, la adhesión, el vWF actúa formando un puente entre los receptores específicos de la superficie de los trombocitos (Gplb, Gpllb/llla) y los componentes del endotelio.

Los cambios en los niveles del vWF pueden provocar graves problemas hemorrágicos.

La enfermedad de Von Willebrand (vWD) es una enfermedad hereditaria autosómica de la sangre prevalente en alrededor del 0, 8% y está causada principalmente por una deficiencia o una composición multimérica anormal del vWF. Consecuentemente, la actividad de la coagulación del FVIII (FVIII:C) se ve a menudo reducida, ya que el vWF no puede realizar su función estabilizante del FVIII. Los pacientes que padecen la vWD pueden mostrar síntomas similares a los de la hemofilia A, causada por una disminución en la semivida del FVIII.

La relevancia del vWF para la adhesión de las plaquetas al endotelio dañado se refleja en el hecho de que los pacientes con vWD tienen a menudo un tiempo de hemorragia elevado; por lo tanto, el principal objeto del tratamiento de la vWD es la corrección del tiempo de hemorragia y de la deficiencia en el FVIII.

Actualmente hay dos metodologías terapéuticas para la enfermedad: 1) el uso de desmopresina (1

desamina-8-D-arginina, vasopresina o DDAVP) y 2) la terapia de sustitución con una infusión de concentrados plasmáticos que contienen el vWF. El tratamiento con DDAVP, que estimula la liberación del vWF endógeno desde las células endoteliales, es la terapia de elección, pero en muchos casos los pacientes con vWD no responden a este tratamiento o se vuelven resistentes después de administraciones repetidas, y por lo tanto se hace necesario recurrir al uso de concentrados obtenidos a partir de plasma (crioprecipitados o concentrados de FVIII/vWF) . Sin embargo, los crioprecipitados no están exentos de riesgo de contaminación vírica, ya que no son sometidos a una etapa de inactivación vírica eficaz, y el exceso de proteínas contaminantes, que no son útiles para el paciente, pueden provocar reacciones adversas. Por el contrario, aunque los concentrados del complejo FVIII/vWF se someten a tratamientos eficaces de inactivación/eliminación vírica, el proceso de purificación y los concentrados que se obtienen se han optimizado para el tratamiento de pacientes con hemofilia A y no para aquellos que padecen la 45 enfermedad de von Willebrand. De hecho, se han desarrollado concentrados altamente purificados de FVIII/vWF para pacientes hemofílicos (según se describe, por ejemplo, en el documento WO 01/79260 y en el documento W02008135568) , que, bien contienen un bajo contenido en el vWF, o bien el contenido del FVIII con respecto al del vWF es tan elevado que puede aumentar el riesgo de trombosis en pacientes que padecen vWD (especialmente en la subclase 2N y 3) . Para estos pacientes, que tienen unas concentraciones plasmáticas normales de FVIII, son sin embargo más adecuados los concentrados de vWF que contienen unos niveles despreciables de FVIII.

La fibronectina es otra glucoproteína con un elevado peso molecular (440 KDa) que existe en dos formas: una soluble en el plasma y otra insoluble.

Esta proteína tiene un papel determinante en algunas funciones fisiológicas de extrema importancia para la homeostasis del organismo.

En particular, interactúa con la migración y la diferenciación celular, la regeneración nerviosa, la revascularización y la reparación de lesiones en el epitelio, en las mucosas o en el endotelio. La Fn es capaz de estimular, como opsonina no específica, la fagocitosis del sistema de macrófagos. La deficiencia en esta proteína está acompañada por una reducción en la actividad fagocítica que, en el caso de una infección, puede conducir a un aumento en la mortalidad. Por lo tanto, se ha hipotetizado que la administración de fibronectina exógena puede tener un efecto terapéutico en estados clínicos graves, caracterizados por unos bajos niveles hemáticos de esta glucoproteína y por la propensión a evolucionar hacia un fallo multiorgánico vital, tal como del hígado, de los riñones,

de los pulmones, etc. Estos estados están representados por sepsis, coagulopatías, amplias quemaduras, procedimientos quirúrgicos intensivos.

Otro uso de la Fn en terapia está relacionado con la capacidad de esta proteína de promover la migración celular de neovascularización epidérmica a través del tejido de granulación, y la reorganización de la membrana basal de las células epiteliales y de la mucosa. La Fn juega por tanto un importante papel en el cierre de las lesiones del epitelio y de las mucosas y, por ejemplo, si se aplica en forma de gotas oculares, puede acelerar la reepitelización y la reparación de las lesiones corneales provocadas por traumas o por infecciones.

El reconocimiento del potencial efecto terapéutico del vWF y de la Fn ha aumentado en gran medida el interés por estas proteínas y los esfuerzos para obtener vWF y Fn altamente purificados que respondan a las necesidades terapéuticas y a los requisitos del mercado.

La purificación de proteínas tales como el vWF y la Fn es muy difícil debido a su elevado peso molecular y a sus propiedades adhesivas, que comprometen su recuperación y pueden provocar su deterioro.

Tanto el vWF como la Fn se han purificado por separado usando plasma como material de partida o fracciones enriquecidas tales como criosobrenadante o intermedios derivados de pretratamientos de precipitación y/o de la cromatografía del crioprecipitado.

Berntorp y col. (Vox Sang. 1989, 56: 212) y Winkelman y col. (Vox Sang. 1989, 57: 97) , por ejemplo, purifican el vWF a partir de plasma mediante la precipitación diferencial en presencia de glicina o de sulfato sódico. Perret y

col. (Haemostasis 1984, 14: 289) y Austen y col. (Thromb. Haemostas. 1982, 42: 295) purifican a su vez el vWF a partir de plasma usando diferentes procedimientos de separación cromatográfica, tales como exclusión molecular o intercambio aniónico. Sin embargo, todas estas técnicas producen un vWF con bajos rendimientos y baja pureza.

La patente US 6.579.723 describe un proceso para preparar vWF altamente purificado mediante cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos anti-vWF. Sin embargo, la adición de una subsiguiente etapa de cromatografía de afinidad no ayuda a eliminar totalmente la presencia de anticuerpos residuales, que pueden provocar reacciones inmunológicas.

La patente US 5.408.039, partiendo de una fracción enriquecida en vWF y sometida a una activación vírica,

proporciona dos cromatografías subsiguientes, la primera en Fractogel DEAE TSK 650 y la segunda en gelatina-Sepharose para eliminar la fibronectina, considerada una impureza; a su vez, la patente US 5.252.709 sustituye la última cromatografía por una filtración en gel de Sephacril S-400.

La patente US 2006/0036081, partiendo de una fracción enriquecida obtenida a partir de una etapa precedente de cromatografía en DEAE-Fractogel TSK 650, purifica el vWF, eliminando las impurezas de Fn con una cromatografía en DEAE-Fractogel TSK 650 usando un tampón (acetato sódico 20 mM) con altas velocidades de flujo.

La patente EP0469985B1, partiendo de un crioprecipitado de virus inactivados, purifica el vWF mediante dos etapas cromatográficas con el mismo tipo de resina, que en este caso es la Q-Sepharose FF; el procedimiento usa en la segunda cromatografía un tampón de fuerza iónica que permite al vWF unirse, purificándolo de proteínas tales como fibrinógeno, IgG, fibronectina, albúmina, que no se unen a la resina.

Por su parte, con respecto a la Fn, Mosesson & Umfleet, (1970; J. Biol. Chem. 245, 5728 - 5736) ; Mosher, D.

F. (1975; J. Biol. Chem. 250, 6614 - 6621) la purifican a partir de plasma combinando una etapa de precipitación, una cromatografía de exclusión molecular y una cromatografía de... [Seguir leyendo]

1. Proceso para la producción secuencial de dos proteínas, el vWF y la Fn, partiendo de una fracción biológica enriquecida en vWF y en Fn, caracterizado por una única purificación cromatográfica con una resina de intercambio 5 aniónico fuerte.

2. Proceso según la reivindicación 1 en el que la fracción biológica enriquecida en vWF y en Fn deriva de un tratamiento de purificación precedente mediante una cromatografía de intercambio aniónico realizada sobre: plasma humano, un crioprecipitado u otra fracción plasmática sometida opcionalmente a un tratamiento de prepurificación mediante adsorción en hidróxido de aluminio y sometida opcionalmente a una inactivación vírica.

3. Proceso según la reivindicación 2 en el que la fracción biológica enriquecida en vWF y en Fn es una fracción de desecho del proceso de producción del FVIII.

4. Proceso según la reivindicación 1 en el que la resina de intercambio aniónico fuerte está elaborada con un soporte sintético hidrófilo tentacular que contiene largas cadenas poliméricas portadoras de grupos TMAE en sus extremos.

5. Proceso según las reivindicaciones 1 - 4 en el que la purificación cromatográfica comprende las siguientes etapas:

a) el acondicionamiento de la resina de intercambio aniónico fuerte con un tampón acuoso con un pH comprendido entre 6, 8 y 7, 4, que contiene NaCI a una concentración entre 0, 10 y 0, 15 M, y que comprende opcionalmente glicina y/o CaCI2; b) la carga de la fracción enriquecida en las proteínas de interés; c) la elución de las proteínas contaminantes usando el tampón de acondicionamiento;

d) la elución de una disolución que contiene Fn con un tampón a un pH de entre 6, 8 y 7, 4 que contiene NaCI a una concentración comprendida entre 0, 2 y 0, 27 M y en el que hay opcionalmente presente CaCI2 a una concentración comprendida entre 1 y 5 mM, e) la elución de una disolución que contiene vWF con un tampón a un pH de entre 6, 8 y 7, 4 que contiene NaCI a una concentración comprendida entre 0, 6 y 1, 0 M y en el que hay opcionalmente presente CaCI2 a una concentración comprendida entre 1 y 5 mM.

FIGURA 1

Multímeros del vWF: a) plasma b) fracción de NaCl 0, 22 M dializada c) fracción de NaCl 0, 60 M dializada

FIGURA 2

SDS-PAGE en condiciones no reductoras 1:intervalo de Alto Estándar puro 2:material de partida 0, 16M 3:intermedio 0, 22 .

4. 5:eluido 0, 60 M (W2)