Mutantes de alfa-amilasa.

Variante de una α-amilasa tipo Termamyl progenitora, donde la α

-amilasa tipo Termamyl progenitora se selecciona de:

(i) SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7 o SEC ID n.º: 8o

(ii) una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl con al menos un 80% de homología a una de las secuencias en (i); y

donde la variante tiene actividad de α-amilasa y comprende las mutaciones R181* y G182* y una sustitución seleccionadade N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (con respecto a SEC ID n.º: 6) o en posicionescorrespondientes en otras α-amilasas de tipo Termamyl progenitoras, y

donde la variante muestra una termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a una concentración de Ca2+ inferior a 40 ppm,en comparación con una variante correspondiente que comprende las mutaciones R181* y G182* sin la sustitución a N195.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10182050.

Solicitante: NOVOZYMES A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: Krogshøjvej 36 2880 Bagsvaerd DINAMARCA.

Inventor/es: SVENDSEN, ALLAN, BORCHERT, TORBEN VEDEL, BISGÅRD-FRANTSEN,HENRIK.

Fecha de Publicación: 28 de Agosto de 2013.

Clasificación Internacional de Patentes:

C11D3/386 QUIMICA; METALURGIA. › C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS. › C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA. › C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
C12N1/21 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
C12N9/28 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › alfa-amilasa de origen microbiano, p. ej. amilasa bacteriana.

PDF original: ES-2436066_T3.pdf

Fragmento de la descripción:

Mutantes de alfa-amilasa

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, entre otras cosas, a variantes nuevas (mutantes) de α-amilasas progenitoras de tipo Termamyl, sobre todo variantes que presentan termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ (con respecto a la progenitora) que son ventajosas respecto a las aplicaciones de las variantes en el tratamiento de almidón industrial particularmente (p. ej. licuefacción o sacarificación del almidón) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las α-amilasas (α-1, 4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3, 2, 1, 1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la 15 hidrólisis del almidón y otros oligo- y polisacáridos 1, 4-glucosídicos lineales y ramificados.

Hay un cuerpo muy extenso de patentes y de bibliografía científica acerca de esta clase de enzimas muy importante industrialmente. Varias α-amilasas tales como variantes de α-amilasas tipo Termamyl son conocidas a partir de p. ej. WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.

Entre las descripciones más recientes referentes a las α-amilasas, WO 96/23874 proporciona datos estructurales tridimensionales de cristales de rayos X para una α-amilasa tipo Termamyl que consiste en los 300 residuos N-terminales de aminoácidos de la α-amilasa de B. amyloliquefaciens y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la α-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos (estando disponible comercialmente bajo el nombre comercial

Termamyl™) , y que está así cercanamente relacionada con las α-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en el contexto presente están incluidas dentro del significado del término "α-amilasas tipo Termamyl", y que incluyen, entre otras cosas, las α-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophilus) . WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, basándose en un análisis de la estructura de una α-amilasa progenitora tipo Termamyl, variantes de la α-amilasa progenitora tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas con respecto a la progenitora.

El documento WO 95/35382 (Gist Brocades B.V.) se refiere a enzimas amilolíticas derivadas de B. licheniformis con propiedades mejoradas que permiten la reducción de la concentración de Ca2+ bajo la aplicación sin una pérdida de rendimiento de la enzima. La enzima amilolítica comprende uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones seleccionadas del grupo de 104, 128, 187, 188 de la secuencia de α-amilasa de B. licheniformis.

El documento WO 96/23873 (Novo Nordisk) expone variantes de α-amilasa tipo Termamyl que tienen termoestabilidad aumentada obtenida por la deleción de pares en la región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC ID N.º: 1 de la misma.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a nuevas variantes α-amilolíticas (mutantes) de una α-amilasa tipo Termamyl, en particular variantes que exhiben termoestabilidad aumentada (en relación al progenitor) que son ventajosas en relación al

procesado industrial de almidón (licuefacción de almidón, sacarificación y similares) .

Más específicamente, la presente invención proporciona una variante de una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl tal y como se define por la reivindicación 1.

La presente invención sigue al hallazgo sorprendente de los inventores de que en caso de combinar dos mutaciones (se describirá a continuación) , la termoestabilidad de las α-amilasas de tipo Termamyl se aumenta a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ en comparación con mutaciones únicas, como la mutación descrita en WO 96/23873 (Novo Nordisk) , es decir deleción de pares en la región R181*, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 1 de la presente.

La invención se refiere adicionalmente a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a la composición que comprende variantes de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de las variantes y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas α-amilolíticas, en varios procesos industriales, p. ej., licuefacción de almidón.

BREVE DESCRIPCIÓN DEL DIBUJO

Figura 1 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de seis α-amilasas progenitoras de tipo Termamyl en el contexto de la invención. Los números en el extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas de la siguiente manera:

1: SEC ID n.º: 2,

2: Kaoamyl,

3: SEC ID n.º: 1,

4: SEC ID n.º: 5,

5: SEC ID n.º: 4,

6: SEC ID n.º: 3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La α-amilasa tipo Termamyl

Es bien sabido que varias α-amilasas producidas por Bacillus spp. son altamente homólogas a nivel aminoácido. Por ejemplo, la α-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 4 (comercialmente disponible como Termamyl™) se ha descubierto que es aproximadamente un 89% homóloga a la αamilasa de B. amiloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 5 y aproximadamente un 79% homóloga a la α-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N.º: 3. α-amilasas homólogas adicionales incluyen una α-amilasa derivada de una cepa de Bacillus sp. NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375, todas las cuales se describen en detalle en WO 95/26397, y la αamilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988) , pp. 25-31.

Otras α-amilasas homólogas adicionales incluyen la α-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en el documento EP 0252666 (ATCC 27811) , y las α-amilasas identificadas en los docuementos WO 91/00353 y WO 94/18314. Otras α-amilasas de tipo Termamyl de B.licheniformis comerciales son Optitherm™ y Takatherm™ (disponibles de Solvay) , Maxamyl™ (disponible de Gist-Brocades/Genencor) , Spezym AA™ y Spezyme AA™ de Delta (disponible de Genencor) , y Keistase™ (disponible de Daiwa) .

Debido a la homología sustancial encontrada entre estas α-amilasas, se considera que pertenecen a la misma clase de α-amilasas, específicamente la clase de "α-amilasas tipo Termamyl".

Por consiguiente, en el presente contexto, el término "α-amilasa tipo Termamyl" se destina a indicar una α-amilasa que, a nivel de aminoácidos, muestra una homología sustancial con Termamyl™, es decir la α-amilasa de B. licheniformis con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 4 de la presente. Más específicamente, una α-amilasa tipo Termamyl es una α-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID n.º: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 o 8 de la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 1 del documento WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID n.º: 7 aquí) o en SEC ID n.º: 2 del documento WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC ID n.º: 8 aquí) o en el Tsukamoto et al., 1988, (que la secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID N.º: 6 aquí) o que muestra al menos un 80%, especialmente al menos un 85%, especialmente preferido al menos un 90%, más preferido incluso especialmente al menos un 95% de homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID n.º 1 o 2 o 3 o 4 o 5 o 6 o 7 o 8.

Opcionalmente, la α-amilasa tipo Termamyl puede adicionalmente i) mostrar reactividad inmunológica cruzada con un anticuerpo dirigido contra al menos una de dichas α-amilasas, y/o ii) ser codificado por una secuencia de ADN que se hibridiza con las secuencias de ADN que codifican las α-amilasas especificadas anteriormente que son evidentes de SEC ID n.º: 9, 10, 11, o 12 de la presente solicitud (las cuales secuencias de codificación codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en la SEC ID n.º: 1, 2, 3, 4 y 5 de la presente, respectivamente) , de SEC ID n.º: 4 del documento WO 95/26397 (la

cual secuencia de ADN, junto con el codón de terminación TAA, se muestra en SEC ID n.º: 13 de la presente y codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en SEC ID n.º: 8 de la presente) y de SEC ID n.º: 5 del documento WO 95/26397 (mostrada en SEC ID n.º: 14 de la presente) ,... [Seguir leyendo]

Reivindicaciones:

1. Variante de una α-amilasa tipo Termamyl progenitora, donde la α-amilasa tipo Termamyl progenitora se selecciona de:

(i) SEC ID n.º: 1, SEC ID n.º: 2, SEC ID n.º: 3, SEC ID n.º: 4, SEC ID n.º: 5, SEC ID n.º: 6, SEC ID n.º: 7 o SEC ID n.º: 8 o

(ii) una α-amilasa progenitora de tipo Termamyl con al menos un 80% de homología a una de las secuencias en (i) ; y

donde la variante tiene actividad de α-amilasa y comprende las mutaciones R181* y G182* y una sustitución seleccionada de N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, F, P, S, T, W, Y, V (con respecto a SEC ID n.º: 6) o en posiciones correspondientes en otras α-amilasas de tipo Termamyl progenitoras, y donde la variante muestra una termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a una concentración de Ca2+ inferior a 40 ppm, en comparación con una variante correspondiente que comprende las mutaciones R181* y G182* sin la sustitución a N195.

2. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión recombinante que lleva un constructo de ADN según la reivindicación 2.

4. Célula que se transforma con un constructo de ADN según la reivindicación 2 o un vector según la reivindicación 3.

5. Célula según la reivindicación 4, que es un microorganismo.

6. Aditivo de detergente que incluye una variante de α-amilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1, opcionalmente en forma de granulado que no forma polvo, líquido estabilizado o enzima protegida.

7. Composición de detergente que incluye una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.

8. Composición para detergente de lavado de vajilla manual o automático que incluye una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.

9. Composición de lavado de ropa manual o automático que incluye una variante de α-amilasa según la reivindicación 1.

10. Composición comprendiendo:

(i) una mezcla de la α-amilasa de B. licheniformis con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 4 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivada de (como la α-amilasa progenitora de tipo Termamyl) la α-amilasa de B. stearothermophilus con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 3 o

(ii) una mezcla de la α-amilasa de B. stearothermophilus con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 3 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivadas de una o varias otras α-amilasas de tipo Termamyl progenitoras; o

(iii) una mezcla de una o más variantes según la reivindicación 1 derivada de (como la α-amilasa progenitora de tipo Termamyl) la α-amilasa de B. stearothermophilus con la secuencia mostrada en SEC ID n.º: 3 con una o más variantes según la invención derivadas de una o varias otras α-amilasas progenitoras de tipo Termamyl.

11. Uso de una variante de α-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para lavado de ropa y/o vajilla.

12. Uso de una variante de α-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 9 para el desencolado textil.

13. Uso de una variante de α-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 9 para la licuefacción de almidón.

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