Modulación de identificación de exones en pre-ARNm por interferencia con la estructura secundaria del ARN.

Método para generar un oligonucleótido que comprende determinar,

de una estructura secundaria de ARN de unexón, una región que se hibrida con otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida endicha estructura (estructura abierta), y posteriormente generar un oligonucleótido, del cual al menos tres nucleótidosconsecutivos de dicho oligonucleótido son complementarios a dicha estructura cerrada y del cual al menos otros tresnucleótidos consecutivos de dicho oligonucleótido son complementarios a dicha estructura abierta y donde el gen dedicho ARN que comprende dicho exón es transcrito, codifica un gen de distrofia muscular de Duchenne (DMD), un gende colágeno VI alfa 1 (COL6A1), un gen de miopatía miotubular 1 (MTM1), un gen de disferlina (DYSF), un gen delaminina alfa 2 (LAMA2), un gen de la distrofia muscular de Emery-Dreifuss (EMD) y/o un gen de calpaína 3 (CAPN3).

Modulación de identificación de exones en pre-ARNm por interferencia con la estructura secundaria del ARN

La invención se refiere a los campos de la biología molecular y la medicina. Más concretamente la invención se refiere a un método para generar un oligonucleótido para la reestructuración de ARNm producido a partir de pre-ARNm.

El dogma central de la biología es que la información genética reside en el ADN de una célula y se expresa sobre la transcripción de esta información, donde después de la producción de la proteína codificada continua la maquinaria de traducción de la célula. Esta visión del flujo de la información genética ha dado lugar a la estrategia predominantemente basada en el ADN para interferir con el contenido proteínico de una célula. Este punto de vista está cambiando lentamente y se están buscando alternativas a la interferencia a nivel del ADN.

En los eucariotas superiores la información genética para proteínas en el ADN de la célula se codifica en exones, que están separados entre sí por secuencias intrónicas. Estos intrones son muy largos en algunos casos. La maquinaria de transcripción genera un pre-ARNm que contiene tanto exones como intrones, mientras la maquinaria de empalme, frecuentemente ya durante la producción del pre-ARNm, genera la auténtica región de codificación para la proteína mediante el empalme de los exones presentes en el pre-ARNm.

Aunque se sabe mucho acerca de los procesos reales implicados en la generación de un ARNm a partir de un pre-ARNm, también mucho permanece oculto. En la presente invención se ha demostrado que es posible influir en el proceso de empalme de manera que se produzca un ARNm diferente. El proceso permite la reestructuración predecible y reproducible de ARNm producido por una maquinaria de empalme. Un oligonucleótido capaz de hibridarse con pre-ARNm en una ubicación de un exón que está normalmente incluido en el ARNm maduro puede dirigir la exclusión del exón así escogido como diana o una parte del mismo.

En la presente invención se proporcionan medios y métodos para el diseño de oligonucleótidos complementarios apropiados. Con este fin la invención proporciona un método para generar un oligonucleótido determinando, a partir de una estructura secundaria (predicha) de ARN de un exón, una región que adopta una estructura que se hibrida con otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida con dicha estructura (estructura abierta) , y consecuentemente generando un oligonucleótido que, al menos en parte, es complementario a dicha estructura abierta y que, al menos en parte, es complementario a dicha estructura cerrada. Las moléculas de ARN presentan estructuras secundarias fuertes, principalmente debido al apareamiento de bases en tramos complementarios o parcialmente complementarios dentro del mismo ARN. Se piensa desde hace mucho tiempo que las estructuras en el ARN juegan un papel en la función del ARN. Sin estar obligado por la teoría, se cree que la estructura secundaria del ARN de un exón juega un papel en la estructuración del proceso de empalme. A través de su estructura, un exón es reconocido como una parte que necesita ser incluida en el ARNm. Aquí, esta función de señalización es referida como una señal de inclusión de exón. Un oligonucleótido complementario de la divulgación es capaz de interferir con la estructura del exón y de este modo capaz de interferir con la señal de inclusión del exón. Se ha descubierto que muchos oligonucleótidos complementarios de hecho incluyen esta capacidad, algunos más eficazmente que otros. Los oligonucleótidos de la divulgación, es decir, aquellos con el mencionado solapamiento dirigido hacia estructuras cerradas y abiertas en el ARN de exón nativo, son una selección a partir de todos los oligonucleótidos posibles. La selección abarca oligonucleótidos que pueden interferir eficazmente con una señal de inclusión de exón. Sin estar obligado por la teoría se piensa que el solapamiento con una estructura abierta mejora la eficiencia de invasión del oligonucleótido (es decir, aumenta la eficiencia con la cual el oligonucleótido puede penetrar la estructura) , mientras que el solapamiento con la estructura cerrada aumenta posteriormente la eficiencia de interferencia con la estructura secundaria del ARN del exón y de este modo interfiere con la señal de inclusión de exón. Se ha descubierto que la longitud de complementariedad parcial tanto para la estructura cerrada como para la abierta no está sujeta a grandes restricciones. Hemos observado eficiencias altas en oligonucleótidos con longitudes de complementariedad variables en ambos tipos de estructuras. El término complementariedad se utiliza en este caso para referirse a un tramo de ácidos nucleicos que puede hibridarse con otro tramo de ácidos nucleicos bajo condiciones fisiológicas. No es, por consiguiente, en absoluto requerido que todas las bases en la región de complementariedad sean capaces de aparearse con bases en la cadena opuesta. Por ejemplo, al diseñar el oligonucleótido uno puede querer incorporar un residuo que no se aparee con la base en la cadena complementaria. Los apareamientos erróneos se pueden permitir hasta cierto punto si, bajo las circunstancias en la célula, el tramo de nucleótidos es capaz de hibridarse con la parte complementaria. En una realización preferida, una parte complementaria (tanto a la mencionada estructura abierta como a la mencionada estructura cerrada) comprende al menos 3 o preferiblemente al menos 4 nucleótidos consecutivos. Las regiones complementarias son preferiblemente diseñadas de manera que, cuando se combinan, son específicas para el exón en el pre-ARNm. Tal especificidad se puede crear con varias longitudes de regiones complementarias ya que ésta depende de las secuencias reales en otro (pre-) ARNm en el sistema. El riesgo de que también uno o más pre-ARNm sean capaces de hibridarse con el oligonucleótido decrece con el incremento de tamaño del oligonucleótido. Está claro que los oligonucleótidos que contienen apareamientos erróneos en la región de complementariedad, pero que retienen la capacidad para hibridarse con la (s) región (es) seleccionada (s) en el pre-ARNm, se pueden usar en la presente invención. No obstante, es preferible que al menos las partes complementarias no incluyan tales apareamientos erróneos ya que éstas tienen típicamente una eficiencia y especificidad más altas que los oligonucleótidos que tienen tales apareamientos en una o más regiones complementarias. Se piensa que fuerzas de hibridación mayores (es decir, un número creciente de interacciones con la cadena opuesta) son favorables para aumentar la eficiencia del proceso de interferencia con la maquinaria de empalme del sistema.

La estructura secundaria se analiza mejor en el contexto del pre-ARNm donde el exón reside. Tal estructura se puede analizar en el ARN real. No obstante, es posible actualmente predecir bastante bien la estructura secundaria de una molécula de ARN (con costes mínimos de energía) usando programas de modelado de estructuras. Un ejemplo no limitante de un programa adecuado es el servidor RNA mfold versión 3.1 (Mathews et al 1999, J. Mol. Biol. 288: 911940) . Una persona cualificada en la técnica será capaz de predecir, con reproducibilidad adecuada, una estructura probable del exón dada la secuencia de nucleótidos. Las mejores predicciones se obtienen cuando se proporciona a tales programas de modelado las secuencias tanto del exón como del intrón flanqueante. Típicamente no es necesario modelar la estructura de todo el pre-ARNm.

En un primer aspecto se proporciona un método según la reivindicación 1.

Las estructuras abierta y cerrada a las que el oligonucleótido es dirigido, son preferiblemente adyacentes entre sí. Se piensa que de esta manera el alineamiento del oligonucleótido con la estructura abierta induce la apertura de la estructura cerrada con lo cual el alineamiento progresa en esta estructura cerrada. A través de esta acción la estructura previamente cerrada asume una conformación diferente. La conformación diferente produce la interrupción de la señal de inclusión de exón. No obstante, cuando secuencias de apareamiento aceptoras y/o donadoras potenciales (crípticas) están presentes en el exón elegido, ocasionalmente una nueva señal de inclusión de exón se genera definiendo un (neo) exón diferente, es decir, con un extremo 5' diferente, un extremo 3' diferente o ambos. Este tipo de actividad está dentro del ámbito de la presente invención ya que el exón escogido como diana es excluido del ARNm. La presencia de un nuevo exón, que contiene parte del exón escogido, en el ARNm no altera el hecho de que el exón escogido, como tal, es excluido.... [Seguir leyendo]

1. Método para generar un oligonucleótido que comprende determinar, de una estructura secundaria de ARN de un exón, una región que se hibrida con otra parte de dicho ARN (estructura cerrada) y una región que no se hibrida en 5 dicha estructura (estructura abierta) , y posteriormente generar un oligonucleótido, del cual al menos tres nucleótidos consecutivos de dicho oligonucleótido son complementarios a dicha estructura cerrada y del cual al menos otros tres nucleótidos consecutivos de dicho oligonucleótido son complementarios a dicha estructura abierta y donde el gen de dicho ARN que comprende dicho exón es transcrito, codifica un gen de distrofia muscular de Duchenne (DMD) , un gen de colágeno VI alfa 1 (COL6A1) , un gen de miopatía miotubular 1 (MTM1) , un gen de disferlina (DYSF) , un gen de laminina alfa 2 (LAMA2) , un gen de la distrofia muscular de Emer y -Dreifuss (EMD) y/o un gen de calpaína 3 (CAPN3) .

2. Método según la reivindicación 1, donde dichas estructuras cerradas y abiertas son adyacentes entre sí.

3. Método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, donde dicho oligonucleótido es complementario a una parte 15 consecutiva de entre 14 y 50 nucleótidos de dicho ARN.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho oligonucleótido comprende ARN.

5. Método según la reivindicación 4, donde dicho ARN contiene una modificación, preferiblemente una modificación de 20 ribosa (ARN) o desoxirribosa (ADN) modificada co.

2. O-metilo.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el pre-ARNm que comprende dicho exón exhibe empalme no deseado en un sujeto.

7. Método según la reivindicación 6, donde la ausencia de dicho exón del ARNm producido a partir de dicho pre-ARNm, genera una región de codificación para una proteína.

8. Método según la reivindicación 6 o reivindicación 7, donde dicho gen es el gen de la distrofia muscular de Duchenne.

9. Método según la reivindicación 8, donde dicho exón comprende los exones 2, 8, 9, 17, 19, 29.

4. 46.

4. 53, 55 o 59.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde un equivalente de dicho oligonucleótido es generado comprendiendo características similares de hibridación en tipo, no necesariamente en cantidad.

11. Método según la reivindicación 10, donde dicho equivalente comprende ácido nucleico peptídico, ácido nucleico bloqueado y/o un morfolino fosforodiamidato o una combinación de los mismos.

12. Método según la reivindicación 11, donde dicho equivalente comprende ácido nucleico bloqueado.

13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, donde el oligonucleótido o el equivalente del mismo, no se solapa con una secuencia de empalme donadora y/o una secuencia de empalme aceptora de dicho exón.

14. Método para producir un compuesto capaz de hibridarse al menos con dos exones en un pre-ARNm codificado por un gen, que comprende producir un compuesto que comprende al menos dos partes donde una primera parte 45 comprende un oligonucleótido con al menos 8 nucleótidos consecutivos que son complementarios al primero de dichos dos exones y donde una segunda parte comprende un oligonucleótido con al menos 8 nucleótidos consecutivos que son complementarios a un segundo exón en dicho pre-ARNm, dicho compuesto que comprende entre 16 a 80 nucleótidos, donde dicho gen es un gen de la distrofia muscular de Duchenne, un gen de colágeno VI alfa 1 (COL6A1) , un gen de miopatía miotubular 1 (MTM1) , un gen de disferlina (DYSF) , un gen de laminina alfa 2 (LAMA2) , un gen de la distrofia 50 muscular de Emer y -Dreifuss (EMD) y/o un gen de calpaína 3 (CAPN3) .

15. Método según la reivindicación 14, donde dicho primer y dicho segundo exón están separados en dicho pre-ARNm por al menos un exón al cual dicho oligonucleótido no es complementario.

16. Método según la reivindicación 14 o reivindicación 15, donde tramos de nucleótidos complementarios a dichos al menos dos exones están separados por una fracción de unión.

17. Método según la reivindicación 16, donde dicha fracción de unión comprende entre 4 y 40 nucleótidos,

preferiblemente comprendiendo al menos 4 nucleótidos de uracilo. 60

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14-17, donde un equivalente de dicho compuesto se produce, preferiblemente un equivalente según la reivindicación 11.