Métodos para determinar los perfiles de metilación.

Un método para determinar el perfil de metilación de ADN de una célula,

tejido u organismo, comprendiendo el método las etapas de:

a. proporcionar una población de fragmentos de ADN escindidos al azar o sometidos a cizalla a partir de una célula, tejido, u organismo, en donde el DNA comprende fragmentos metilados y no metilados;

b. agotar el ADN metilado o no metilado de la población; y

c. cuantificar la cantidad de al menos una secuencia de ADN metilado en la población agotada o del ADN no metilado en la población agotada con respecto a la cantidad de la al menos una secuencia en el ADN genómico total.

Métodos para determinar los perfiles de metilación

Campo de la invención La presente invención se refiere a la determinación de los perfiles de metilación.

Estado de los derechos de las invenciones realizadas bajo investigación y desarrollo patrocinados por el gobierno federal

Esta invención se realizó con el patrocinio del Gobierno bajo la Concesión Núm. NSF 0077774, emitido por la National Science Foundation. El gobierno tiene ciertos derechos en esta invención.

Antecedentes de la invención La metilación del ADN es un proceso biológico ubicuo que se produce en diversos organismos que abarcan desde bacterias a seres humanos. Durante este proceso, las metiltransferasas de ADN catalizan la adición post-replicativa de un grupo metilo a la posición N6 de la adenina o al C5 o la posición N4 de la citosina, para lo cual la Sadenosilmetionina es el donante universal del grupo metilo. En eucariotas superiores, la metilación del ADN juega un papel en la impronta genómica. Además, las aberraciones en la metilación del ADN han sido implicadas en el envejecimiento y en diversas enfermedades incluyendo el cáncer.

Por lo tanto, existe la necesidad de métodos para determinar el perfil de metilación de una célula individual o un organismo. La presente invención aborda este y otros problemas.

Breve resumen de la invención La presente invención proporciona métodos para determinar un perfil de metilación de ADN de una célula, tejido, u organismo. Los métodos comprenden las etapas de:

a. proporcionar una población de fragmentos de ADN escindidos al azar o sometidos a cizalla de la célula, tejido, u organismo, en donde el ADN comprende fragmentos metilados y no metilados;

b. agotar el ADN metilado o no metilado de la población; y

c. cuantificar la cantidad de al menos una secuencia del ADN metilado de la población agotada o del ADN no metilado de la población agotada con respecto a la cantidad de la al menos una secuencia del ADN genómico total.

En algunas realizaciones la etapa de agotamiento comprende la fragmentación de la población con una enzima de restricción sensible a la metilación o una enzima de restricción dependiente de la metilación para producir ADN digerido y ADN no digerido y separar el ADN digerido del ADN no digerido.

En algunas realizaciones:

etapa a. comprende proporcionar una población de fragmentos de ADN escindidos al azar o sometidos a cizalla de una célula, tejido, u organismo, en donde el ADN comprende una primera porción y una segunda porción y cada porción comprende nucleótidos metilados y no metilados;

etapa b. comprende agotar el ADN metilado o no metilado de la segunda porción;

etapa c. comprende cuantificar la cantidad relativa de al menos una secuencia específica en al menos dos muestras de ADN seleccionadas del grupo que consiste en la primera porción, el ADN metilado de la segunda porción, y el ADN no metilado de la segunda porción,

determinando de ese modo el perfil de metilación de varias de tales secuencias de ácido nucleico de la célula u organismo.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden las etapas de:

marcar las al menos dos muestras de ADN con diferentes marcas, y

hibridar las al menos dos muestras de ADN a un ácido nucleico; y determinar la hibridación relativa de las al menos dos muestras de ADN a la secuencia específica calculando la proporción de las dos marcas hibridantes.

En algunas realizaciones, la etapa de cuantificación comprende la amplificación cuantitativa.

En algunas realizaciones, las al menos dos muestras de ADN son el ADN metilado de la segunda porción y el ADN no metilado de la segunda porción. En algunas realizaciones, las al menos dos muestras de ADN son la primera porción y el ADN metilado de la segunda porción. En algunas realizaciones, las al menos dos muestras de ADN son las primera porción y el ADN no metilado de la segunda porción.

En algunas realizaciones, el ADN escindido al azar o sometido a cizalla comprende secuencias de reconocimiento metiladas y no metiladas de una enzima de restricción sensible a metilo y la etapa de agotamiento comprende la escisión de la segunda porción con una enzima de restricción sensible a metilo. En algunas realizaciones, el ADN escindido al azar o sometido a cizalla comprende secuencias de reconocimiento metiladas y no metiladas de de una enzima de restricción dependiente de metilo y la etapa de agotamiento comprende la escisión de la segunda porción con la enzima de restricción dependiente de metilo.

En algunas realizaciones, el ácido nucleico está conectado a un soporte sólido. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una micromatriz. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una cuenta. En algunas realizaciones, el soporte sólido es una matriz.

En algunas realizaciones, el organismo es una planta. En algunas realizaciones, el organismo es un hongo. En algunas realizaciones, el organismo es un procariota. En algunas realizaciones, el procariota es un patógeno bacteriano. En algunas realizaciones, el patógeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en especies gram positivas y gram negativas y micobacterias. En algunas realizaciones, el organismo es un animal. En algunas realizaciones, el animal es un ser humano.

En algunas realizaciones, la célula es una célula pluripotencial. En algunas realizaciones, la célula es transgénica y el ácido nucleico corresponde al sitio de inserción de un transgén. En algunas realizaciones, el tejido es la sangre. En algunas realizaciones, el tejido es tejido de biopsia. En algunas realizaciones, el tejido es tejido resecado. En algunas realizaciones, el tejido es normal. En algunas realizaciones, el tejido es tejido tumoral. En algunas realizaciones, el tejido es precanceroso.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente la comparación del perfil de metilación de un ácido nucleico con la transcripción del ácido nucleico, determinando de ese modo la relación entre la metilación y la transcripción del ácido nucleico. En algunas realizaciones, la transcripción del ácido nucleico se detecta por medio de una micromatriz.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente la comparación del perfil de metilación de un ácido nucleico con el número de copias del ácido nucleico, determinando de ese modo la contribución a un fenotipo de la combinación de la metilación del ácido nucleico y el número de copias del ácido nucleico. En algunas realizaciones, el número de copias del ácido nucleico se detecta con una micromatriz.

En algunas realizaciones, los métodos comprenden adicionalmente la comparación del perfil de metilación de un espécimen de un patógeno bacteriano con una cepa de referencia del patógeno, en donde la similitud de los patrones de metilación indica el origen común del espécimen y la cepa de referencia.

La presente invención puede utilizar micromatrices de polinucleótidos. Las micromatrices de polinucleótidos pueden hibridar a una primera y una segunda porciones de ADN marcadas, en donde las porciones son de poblaciones de tamaño uniforme de ADN escindido al azar o sometido a cizalla de una célula, tejido, u organismo; en donde la primera porción de ADN comprende ADN no metilado y metilado marcado con una primera marca; y en donde la segunda porción de ADN tiene agotado el ADN no metilado o el ADN metilado y la segunda porción de ADN está marcada con una segunda marca diferente de la primera marca.

En algunas realizaciones, la segunda porción de ADN de ensayo tiene agotado el ADN metilado. En algunas realizaciones, la segunda porción de ADN de ensayo tiene agotado el ADN no metilado. En algunas realizaciones, la segunda porción de ADN se agota mediante tratamiento del ADN escindido al azar o sometido a cizalla con una enzima de restricción sensible a metilo o dependiente de metilo y la selección del ADN no escindido.

En algunas realizaciones, las poblaciones de ADN son de una planta. En algunas realizaciones, las poblaciones de ADN son de un animal. En algunas realizaciones, las poblaciones de ADN son de un hongo. En algunas realizaciones, las poblaciones de ADN son de un procariota. En algunas realizaciones, el procariota es un patógeno bacteriano. En algunas realizaciones, el patógeno bacteriano se selecciona del grupo que consiste en bacterias gram negativas y gram positivas, que incluyen Listeria, E. coli, Salmonella, Yersinia, y Neisseria, y micobacterias. En algunas realizaciones, las poblaciones de ADN son de un organismo, célula, o tejido transgénicos.

En algunas realizaciones, la micromatriz de polinucleótidos comprende... [Seguir leyendo]

1. Un método para determinar el perfil de metilación de ADN de una célula, tejido u organismo, comprendiendo el método las etapas de:

a. proporcionar una población de fragmentos de ADN escindidos al azar o sometidos a cizalla a partir de una célula, tejido, u organismo, en donde el DNA comprende fragmentos metilados y no metilados;

b. agotar el ADN metilado o no metilado de la población; y

c. cuantificar la cantidad de al menos una secuencia de ADN metilado en la población agotada o del ADN no metilado en la población agotada con respecto a la cantidad de la al menos una secuencia en el ADN genómico total.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el tamaño medio de los fragmentos de ADN está entre 0, 1-10 kb.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la etapa de agotamiento comprende: fragmentar la población con una enzima de restricción sensible a la metilación o una enzima de restricción dependiente de la metilación para producir ADN digerido y ADN no digerido; y separar el ADN digerido del ADN no digerido.

4. Un método de acuerdo con la reivindicación1 o 2, en donde: la etapa a comprende proporcionar una población de fragmentos de ADN escindidos al azar o sometidos a cizalla de una célula, tejido, u organismo, en donde el ADN comprende una primera porción y una segunda porción y cada porción comprende fragmentos metilados y no metilados; la etapa b comprende agotar el ADN metilado o no metilado de la segunda porción; y la etapa c comprende cuantificar la cantidad relativa de al menos una secuencia de al menos dos de las siguientes: la primera porción, ADN metilado de la segunda porción, y ADN no metilados de la segunda porción.

5. El método de la reivindicación 4, en donde la etapa de cuantificación comprende la amplificación cuantitativa.

6. El método de la reivindicación 4, en donde la etapa de agotamiento comprende: fragmentar la segunda porción con una enzima de restricción sensible a la metilación o una enzima de restricción dependiente de la metilación para producir ADN digerido y ADN no digerido; y separar el ADN digerido del ADN no digerido, y en donde dicho método comprende adicionalmente: marcar la primera porción con una marca; marcar el ADN digerido o no digerido de la segunda porción con una marca; hibridar el ADN marcado de la primera y segunda porciones a un ácido nucleico; y determinar la metilación relativa de un ácido nucleico detectando la primera y la segunda marcas que hibridan con el ácido nucleico, hibridar con el ácido nucleico, determinando de ese modo el perfil de metilación de al menos una secuencia de ácido nucleico de la célula, tejido, u organismo.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ADN metilado se agota a partir del ADN escindido al azar o sometido a cizalla.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el ADN no metilado se agota a partir del ADN escindido al azar o sometido a cizalla.

9. El método de la reivindicación 4, en donde la etapa de cuantificación comprende hibridar el ADN reducido del ADN metilado o no metilado con un ácido nucleico conectado a un soporte sólido.

10. El método de una cualquier de las reivindicaciones anteriores, en donde el organismo se selecciona entre una planta, un animal, un hongo, y un procariota.

11. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el método comprende adicionalmente comparar el perfil de metilación de un ácido nucleico con un perfil de transcripción del ácido nucleico, determinando de ese modo la relación entre el perfil de metilación y el perfil de transcripción del ácido nucleico.

12. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde el método comprende adicionalmente comparar el perfil de metilación de un ácido nucleico con un perfil del estado de empaquetamiento de la cromatina del ácido nucleico, determinando de ese modo la relación entre el perfil de metilación y el perfil del estado de empaquetamiento de la cromatina del ácido nucleico.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende adicionalmente comparar el perfil de metilación del ácido nucleico con el número de copias del ácido nucleico, determinando de ese modo la contribución a un fenotipo de la combinación de la metilación del ácido nucleico y el número de copias del ácido nucleico.

14. El método de la reivindicación 4, en donde:

se compara el perfil de metilación de al menos una primera y una segunda muestras de ADN, la etapa a comprende proporcionar una población de fragmentos de ADN escindidos al azar o sometidos a cizalla a partir de las muestras de ADN;

la etapa b comprende:

(i) agotar el ADN metilado o no metilado del ADN escindido al azar o sometido a cizalla de la primera muestra de ADN, y

(ii) opcionalmente agotar el ADN metilado o no metilado del ADN escindido o sometido a cizalla de la segunda muestra de ADN; y

el método comprende adicionalmente:

c. comparar la cantidad de al menos una secuencia de la primera muestra de ADN agotada con la cantidad de la secuencia en la segunda muestra de ADN escindido o sometido a cizalla o la segunda muestra de ADN agotada.