Método para la detección de Chlamydia trachomatis y un kit para el mismo.

Método para la detección de Chlamydia trachomatis, comprendiendo el método la realización de unaamplificación de ADN,

usando un par de cebadores, mediante el uso de ADN que se deriva a partir de unamuestra como molde, y la detección de un producto de amplificación, caracterizado porque el par decebadores usados para la amplificación de ADN se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos delas regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391 en lasecuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, de modo que puede amplificarse la secuencia entre estas dosregiones.

Método para la detección de Chlamydia trachomatis y un kit para el mismo La presente invención se refiere a un método para la detección de Chlamydia trachomatis y a un kit para el mismo.

Chlamydia trachomatis es uno de los patógenos de uretritis no gonocócica que contiene un plásmido críptico [M. Commanducci et al., MoI. Microbiol., 2, n.º 4 (1998) , págs. 531-538]. Se conoce un método para detectar Chlamydia trachomatis, un método para amplificar una secuencia parcial del plásmido críptico mediante un procedimiento de amplificación génica (documentos JP 2719225 y JP 3127135) .

Se ha descrito un ensayo de amplificación para Chlamydia trachomatis, que usa desplazamiento de cadena térmico (documento EP 915170) . Se ha descrito un ensayo de detección basado en la fluorescencia que usa una sonda detectora (documento EP 915173) . Se ha descrito un ensayo para la detección de infección por Chlamydia trachomatis, basado en polipéptidos que comprenden un antígeno de Chlamydia trachomatis (documento WO 014074) . Se ha descrito un método para llevar a cabo una detección por PCR de Chlamydia trachomatis (documento EP 1598431) . Se ha descrito un método de amplificación de ADN y un kit para el mismo, basado en la tecnología de amplificación por PCR (documento EP 1602734) .

Se ha encontrado que surgen problemas con la observación y/o detección de Chlamydia trachomatis en determinadas condiciones. Un artículo de Söderblom et al. (Euro Surveill. 7 de diciembre de 2006; 11 (12) ) : E061207.1) titulado “Impact of a genetic variant of Chlamydia trachomatis on national detection rates in Sweden” informa de que parte de las infecciones de transmisión sexual por Chlamydia trachomatis no pudieron observarse en Suecia mediante las pruebas de laboratorio convencionales producidas por Abbott y Roche, y de que no se observaron bacterias Chlamydia con una variación en la región genética a la que se habían dirigido los cebadores.

Por lo tanto, hay una necesidad de alternativas a las pruebas convencionales mediante la cual, por ejemplo, puedan observarse de hecho tales variantes genéticas de Chlamydia trachomatis.

El objetivo de la presente invención es por tanto proporcionar un método para la detección rápida de Chlamydia trachomatis, que tenga una buena sensibilidad y especificidad, y un kit para el mismo.

El objetivo de la invención se consigue mediante un método para la detección de Chlamydia trachomatis, comprendiendo el método la realización de una amplificación de ADN que implica el uso de un par de cebadores mediante el empleo de ADN derivado a partir de una muestra como molde, y la detección de un producto de amplificación, caracterizado porque el par de cebadores empleado para la amplificación de ADN se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1 (es decir están en la región ORF3 del plásmido críptico mencionado anteriormente, como conoce bien el experto en la técnica) .

Los inventores han encontrado que cuando se lleva a cabo una amplificación de ADN, tal como por ejemplo PCR (siempre que se menciona PCR en el contexto de la presente solicitud, el significado pretendido es el de amplificación de ADN, de la que PCR es una realización) con cebadores que se diseñan basándose en tales regiones específicas en el plásmido críptico de Chlamydia trachomatis, puede observarse rápidamente Chlamydia trachomatis, y también pueden observarse por ejemplo las variantes conocidas de Chlamydia trachomatis, tales como las encontradas por ejemplo en Suecia. Otro método de amplificación de ADN adecuado para la determinación de patógenos se describe en el documento WO 2005/060725 y se incorpora en el presente documento como referencia.

El par de cebadores para la amplificación de ADN, tal como PCR, se diseña preferiblemente basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391, más preferiblemente a los números de nucleótidos de 4291 a 4320 y 4355-4385 y lo más preferiblemente a los números de nucleótidos de 4296 a 4318 y de 4361 a 4382 de SEQ ID No. 1.

Se ha encontrado que los resultados mejoran a medida que aumenta la preferencia para las regiones de nucleótidos basándose en los cuales se diseñan los cebadores independientes para el par de cebadores. Dicho de otro modo, la preferencia dada anteriormente se basa en los mejores resultados obtenidos con el par de cebadores en las regiones preferidas especificadas.

Dicho de otro modo, el par de cebadores con la mayor preferencia se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones en SEQ ID No. 1: GGATT GACTCCGACA ACGTATTC y TGCCCTTTCT AATGGCAATGAT, que corresponden respectivamente a la región de 4296 a 4318 y de 4361 y de 4382 en SEQ ID No. 1. Un primer cebador se dirige preferiblemente a toda la región GGATT GACTCCGACA ACGTATTC, y el segundo cebador del par de cebadores se dirige a toda la región TGCCCTTTCT AATGGCAATGAT. El experto en la técnica comprenderá que las otras regiones descritas anteriormente pueden establecerse basándose en lo que se ha dicho anteriormente.

El experto en la técnica comprenderá que el ADN derivado de una muestra significa el ADN que está aislado o se obtiene a partir de un organismo, tal como una persona, que va a someterse a prueba, pero también incluye copias, replicados y formas procesadas de tal ADN, obtenidas por ejemplo mediante síntesis química o PCR, partiendo del ADN original aislado del organismo.

La muestra usada no se somete a limitaciones particulares, siempre que contenga o pueda contener Chlamydia trachomatis. Ejemplos de esta comprenden orina, raspado uretral (conducto urinario) , frotis de cuello uterino, etc. El ADN puede extraerse a partir de estas muestras mediante el método conocido por el experto en la técnica, mediante el cual puede prepararse ADN, incluyendo ADN del plásmido críptico de Chlamydia trachomatis. Se prefiere particularmente emplear el kit de preparación de ADN de CT COBAS de Roche, porque se ha encontrado que proporciona resultados particularmente ventajosos. Será obvio para el experto en la técnica que el ADN puede ser o bien ADN puro aislado o bien ADN que está presente en un lisado sin procesar.

Poe tanto, los pares de cebadores que pueden emplearse en la invención pueden elegirse en las regiones descritas anteriormente y en particular de tal manera que la región de nucleótidos puede amplificarse/replicarse entre las dos regiones El par de cebadores usado en la presente invención se diseña basándose en una secuencia de nucleótidos de la región que corresponde a los números de nucleótidos de 4261 a 4320, preferiblemente de 4291 a 4320 y más preferiblemente de 4296 a 4318 (primera región) y de 4351 a 4391, preferiblemente 4355-4385 y más preferiblemente de 4361 a 4382 (segunda región) , tal como se mencionó anteriormente y en SEQ ID No. 1, de modo que la secuencia de nucleótidos puede amplificarse (replicarse) entre estas dos regiones con la ayuda del par de cebadores.

Según la invención, la longitud de los cebadores es por ejemplo de entre 10 y 40 nucleótidos. Además, la posición de cada región y la longitud de los cebadores se eligen preferiblemente de modo que el valor de Tm del cebador en cuestión y el molde de ADN correspondiente se encuentra entre 50 y 70ºC, y por tanto la temperatura de hibridación usada en PCR puede fijarse a un valor relativamente alto. El valor de Tm usado aquí es un valor que se calcula mediante el análisis del par de bases vecino más cercano. Los cebadores pueden tener básicamente el mismo valor de Tm.

El experto en la técnica comprenderá que el término “diseñado basándose en” significa que, con las estipulaciones especificadas para el cebador, tales como el valor de Tm y la longitud del cebador, que se describen en el presente documento, el cebador se diseña de modo que puede ser complementario a la secuencia o bien en la cadena sentido o bien en la cadena antisentido de la secuencia de nucleótidos de las regiones según la invención descritas anteriormente y de manera especial en las reivindicaciones. Por tanto, el diseño comienza con la secuencia a la que tiene que unirse el cebador, y con las estipulaciones y en el contexto de la presente invención, el cebador puede ser complementario a la secuencia a la que tiene que unirse.

PCR es el método de detección según la presente invención, y puede llevarse a cabo según el método de PCR normal, siempre que se use como molde el ADN obtenido a partir de la muestra, y que se use un conjunto de cebadores específicos... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de Chlamydia trachomatis, comprendiendo el método la realización de una amplificación de ADN, usando un par de cebadores, mediante el uso de ADN que se deriva a partir de una muestra como molde, y la detección de un producto de amplificación, caracterizado porque el par de cebadores usados para la amplificación de ADN se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, de modo que puede amplificarse la secuencia entre estas dos regiones.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el par de cebadores se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4291 a 4320 y 4355-4385 y preferiblemente a los números de nucleótidos de 4296 a 4318 y de 4361 a 4382 de SEQ ID No. 1.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el par de cebadores se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones en SEQ ID No. 1: GGATT GACTCCGACA ACGTATTC y TGCCCTTTCT AATGGCAATGAT.

4. Kit para la detección de Chlamydia trachomatis llevando a cabo PCR mediante el uso de ADN obtenido a partir de una muestra como molde, comprendiendo el kit un par de cebadores que se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, de modo que puede amplificarse la secuencia entre estas dos regiones.

5. Kit según la reivindicación 4, caracterizado porque el par de cebadores se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391, preferiblemente a los números de nucleótidos de 4291 a 4320 y 4355-4385 y lo más preferiblemente a los números de nucleótidos de 4296 a 4318 y de 4361 a 4382 de SEQ ID No. 1.

6. Kit según las reivindicaciones 4-5, caracterizado porque el par de cebadores se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones en SEQ ID No. 1: GGATT GACTCCGACA ACGTATTC y TGCCCTTTCT AATGGCAATGAT.

7. Par de cebadores diseñados basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391 en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID No. 1, de modo que puede amplificarse la secuencia entre estas dos regiones.

8. Par de cebadores según la reivindicación 7, caracterizado porque se diseña basándose en las secuencias de nucleótidos de las regiones que corresponden a los números de nucleótidos de 4261 a 4320 y de 4351 a 4391, preferiblemente a los números de nucleótidos de 4291 a 4320 y 4355-4385 y lo más preferiblemente a los números de nucleótidos de 4296 a 4318 y de 4361 a 4382 de SEQ ID No. 1.

9. Par de cebadores según las reivindicaciones 7-8, caracterizado porque se diseña basándose en las 45 secuencias de nucleótidos de las regiones en SEQ ID No. 1: GGATT GACTCCGACA ACGTATTC y TGCCCTTTCT AATGGCAATGAT.

10. Par de cebadores según la reivindicación 7, caracterizado porque los cebadores tienen las siguientes secuencias: 5’-GGA TTG ACT CCG ACA ACG TAT TC-3’ (SEQ ID No. 5) y 5’-ATC ATT GCC ATT AGA 50 AAG GGC A-3’ (SEQ ID No. 6) .

11. Conjunto de cebadores que comprende un par de cebadores según una cualquiera de las reivindicaciones 7-10, junto con un cebador complementario que, con respecto a su secuencia, difiere de uno de los cebadores del par de cebadores en un nucleótido.

12. Conjunto de cebadores según la reivindicación 11, que comprende el par de cebadores mencionados en la reivindicación 10 y un cebador complementario con la secuencia 5’-GGA TTG ACT CCA ACA ACG TAT TC-3’ (SEQ ID No. 7) .

13. Sonda de hibridación que comprende un oligonucleótido diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos de una región que corresponde a los números de nucleótidos de 4320 a 4355 de SEQ ID No. 1.

14. Sonda de hibridación según la reivindicación 13, con la secuencia 5’-ACA CCG CTT TCT AAA CCG CCT ACA CGT AA-3’ (SEQ. ID. No. 8) .