Virus con potencia lítica mejorada.

Adenovirus recombinante, competente para replicación, que es capaz de replicarse y que tiene capacidad lítica en las células diana,

siendo dichas células defectuosas en la vía de apoptosis dependiente de p53, siendo el virus un adenovirus condicionalmente de replicación y que comprende en el genoma del mismo la secuencia que codifica una proteína de la vía de apoptosis dependiente de p53, unido funcionalmente a una o más secuencias de control de la expresión funcional en dichas células diana, y que además comprende en el genoma del mismo, como mínimo, el gen que codifica la proteína E1B-55kDa del adenovirus o un mutante de E1B-55kDa capaz de formar un complejo con p53.

Virus con potencia lítica mejorada.

Sector de la invención La presente invención se refiere a los campos de modificación genética, biotecnología y medicina. En particular, la presente invención da a conocer la replicación competente de adenovirus recombinantes con una potencia mejorada para lisar las células en las que se replican. Como resultado, los adenovirus de la presente invención se replican más rápido dentro de una población de células. Por lo tanto, la presente invención da a conocer la preparación eficiente de adenovirus recombinantes y de factores, tales como proteínas, codificadas por dichos adenovirus recombinantes, así como medios eficaces para erradicar ciertas poblaciones de células. La presente invención encuentra aplicaciones útiles en las áreas de producción de adenovirus recombinantes, producción de proteínas recombinantes, producción de vacunas y tratamientos médicos basados en la eliminación de ciertas células del organismo, tales como por ejemplo células cancerosas. El alcance de protección se define en las reivindicaciones.

Antecedentes de la invención Los adenovirus recombinantes se generan a partir del genoma de adenovirus mediante ingeniería genética. Esta ingeniería genética a menudo implica la inserción de ADN heterólogo en el genoma del adenovirus, que incluye sin constituir limitación, al ADN que codifica un producto terapéutico. Se ha de entender, sin embargo, que el término adenovirus recombinante también se refiere a adenovirus en los que se han eliminado partes del genoma del virus sin inserción de ADN heterólogo. Otro ejemplo de un adenovirus recombinante es un adenovirus quimérico que contiene partes de los genomas de adenovirus diferentes.

En el presente documento, se distinguen dos tipos de adenovirus recombinantes, es decir, adenovirus deficientes de replicación y adenovirus competentes de replicación. En los adenovirus deficientes de replicación, se eliminan partes del genoma del virus que son esenciales, como mínimo, para una etapa del ciclo de vida infeccioso del adenovirus (también referido en el presente documento como que le falta la función de replicación) . Por lo tanto, dichos virus recombinantes son deficientes para la replicación, lo que significa que dicho virus recombinante solo es incapaz de completar el ciclo de vida infeccioso del virus. Este tipo de adenovirus recombinante, por lo tanto, sólo puede replicarse en una célula cuando la función de replicación que falta, codificada por dichas partes eliminadas del genoma, se proporcionan a dicha célula por otros medios. Por ejemplo, ese es el caso de las denominadas líneas celulares de empaque, en las que la función de dichas partes eliminadas es proporcionada en el genoma de dichas células, véase por ejemplo, el documento WO 01/44280. Tras la infección por un virus deficiente de replicación, dichas células se pueden complementar para la función de replicación que falta in trans, resultando en la replicación del virus. Ejemplos de adenovirus deficientes de replicación, a menudo referidos como adenovirus incompetentes de replicación, se describen, por ejemplo, en los documentos WO 95/12660, WO 98/46779, WO 98/46781, WO 00/71078 y US 5.932.210.

En el presente documento, se define adenovirus competente de replicación como que el virus comprende, como parte de su genoma, la función para replicarse, como mínimo, en un tipo de células diana, en los que la función de replicación solamente es dependiente de las funciones de replicación proporcionadas por el virus, en combinación con la maquinaria celular endógena de las células diana.

El término “función para replicarse” incluye los factores tales como proteínas, codificadas por el virus, necesarios para la replicación del virus en la célula diana (también referidos en el presente documento como factores de replicación viral) . Tal como se mencionó anteriormente, dichos factores pueden ser endógenos para dicho virus, pero también pueden ser análogos funcionales, codificados por el genoma viral, por ejemplo en casos en los que el gen que codifica el factor viral endógeno se elimina del genoma viral. Es importante señalar que estos factores son codificados por el genoma viral y no son complementados por factores exógenos codificados en las células diana. De esta manera, los virus, en los que la replicación es dependiente de una o más funciones de replicación, se han eliminado del virus, pero se han introducido en la célula diana, se definen que son deficientes de replicación y, por lo tanto, no son parte de la presente invención. La presente invención, tal como se reivindica, se refiere a virus recombinantes competentes para la replicación, es decir, en los que los genes virales que codifican los factores de replicación virales, esenciales para la regulación de la replicación del virus en las células diana, están presentes en el genoma viral.

En un primer tipo de adenovirus recombinantes competentes para la replicación, dichas partes que son esenciales, como mínimo, para una etapa del ciclo de vida infeccioso del adenovirus, también se han eliminado, pero las funciones esenciales de dichas partes son complementadas por la inserción de casetes de expresión funcionales para la proteínas heterólogas que proporcionan dichas funciones esenciales en el genoma del adenovirus recombinante. Este tipo de adenovirus recombinante es referido en el presente documento como un adenovirus heterólogamente transcomplementado y, por lo tanto, es considerado como competente para la replicación, según la definición presentada en el presente documento.

Un segundo tipo de adenovirus recombinante competente para la replicación es el denominado adenovirus condicionalmente de replicacións (CRAd) . En los CRAd, se eliminan dichas una o más partes del genoma del adenovirus, incluyendo las partes que son esenciales, como mínimo, para una etapa del ciclo de vida infeccioso del adenovirus bajo ciertas condiciones fisiológicas (también referidas en el presente documento como “primeras condiciones”) , pero no bajo otras determinadas condiciones fisiológicas (también referidas en el presente documento como “segundas condiciones”) . Dichas segunda y primera condiciones, por ejemplo, podrían ser dictadas por las condiciones fisiológicas que existen en un tipo particular de células (también referidas en el presente documento como “segundas células”) , pero no en otros tipos de células (también referidas en el presente documento como “primeras células”) . Dicho segundo tipo de células, por ejemplo, es una célula derivada de un tipo particular de tejido, en el que dicha célula contiene una proteína que no está o está menos presente que en células de otros tejidos (primer tipo de células) . Un ejemplo de un segundo tipo de célula es una célula que ha perdido el control adecuado del crecimiento celular, tal como por ejemplo una célula cancerosa, en la que dicha célula carece de una proteína que está presente en las células que no tienen un control adecuado del crecimiento celular o en la que dicha célula ha ganado la expresión (o sobreexpresión) de una proteína que no está o está menos presente en células que no tienen un control adecuado del crecimiento celular. Otro ejemplo de dichas segundas condiciones son las condiciones que existen en una etapa particular del ciclo celular o en una etapa de desarrollo particular de la célula, en las que una determinada proteína es específicamente expresada. Por tanto, los CRAd pueden ser diseñados de manera que, la replicación de los mismos es posible en células particulares, tales como células cancerosas o un tipo particular de célula cancerosa, mientras que en células normales, la replicación de los CRAd no es posible. Esto es conocido en la técnica y se hace una revisión, por ejemplo, por Heise y Kirn, J. Clin. Invest. 105 (2000) : 847-851; Alemany y otros, Nat. Biotech. 18 (2000) : 723-727; Gomez-Navarro y Curiel, Lancet Oncol. 1 (2000) : 148-158) .

En un tercer tipo de adenovirus competente para la replicación, no se han eliminado partes del genoma del adenovirus o dichas partes del genoma del adenovirus que se eliminan no incluyen las partes que son esenciales, como mínimo, para una etapa del ciclo de vida infeccioso del adenovirus. Este tipo de adenovirus competente de replicación tiene una capacidad para replicarse en células como lo hace el adenovirus parenteral no modificado y, por lo tanto, es referido como adenovirus competente para la replicación verdadera. En general, la replicación de adenovirus recombinantes está restringida a células de especies animales particulares... [Seguir leyendo]

1. Adenovirus recombinante, competente para replicación, que es capaz de replicarse y que tiene capacidad lítica en las células diana, siendo dichas células defectuosas en la vía de apoptosis dependiente de p53, siendo el virus un adenovirus condicionalmente de replicación y que comprende en el genoma del mismo la secuencia que codifica una proteína de la vía de apoptosis dependiente de p53, unido funcionalmente a una o más secuencias de control de la expresión funcional en dichas células diana, y que además comprende en el genoma del mismo, como mínimo, el gen que codifica la proteína E1B-55kDa del adenovirus o un mutante de E1B-55kDa capaz de formar un complejo con p53.

2. Virus recombinante, según la reivindicación 1, en el que el virus es un adenovirus humano, preferentemente de serotipo 5.

3. Virus recombinante, según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que la expresión de, como mínimo, un gen temprano de adenovirus está controlada por un promotor específico de tumor.

4. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma viral comprende además el gen que codifica la proteína E1B-19 kDa del adenovirus.

5. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho genoma adenoviral comprende la región E1B completa.

6. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma viral comprende uno

o más, preferentemente todos, los genes de la región E4 del adenovirus que codifican las proteínas E4.

7. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el adenovirus porta una mutación en la región E1A que abarca, como mínimo, una parte del dominio CR2 de unión a pRb de E1A, preferentemente una deleción que abarca los aminoácidos 122 a 129 (LTCH-EAGF) de E1A.

8. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la proteína de la vía de apoptosis dependiente de p53 se selecciona del grupo que comprende p53 o un derivado que mantiene la capacidad de inducir apoptosis dependiente de P53, p63, p73, BAX, BAK, BOK/Mtd, BCL-Xs, Noxa/APR, PIDD, p53AlP1, PUMA, KILLER/DR5, Apaf-1, PIG, BID, tBiD, BAD, HRK, Bik/Nbk, BLK, mda-7 o p14ARF.

9. Virus recombinante, según la reivindicación 8, en el que la proteína de la vía de apoptosis dependiente de p53 es la proteína p53, preferentemente p53 humana, o un derivado funcional de la misma, en el que la proteína carece de un dominio de unión funcional para una proteína MDM2 humana.

10. Virus recombinante, según la reivindicación 8 ó 9, en el que la proteína es un derivado funcional de p53 humana con los aminoácidos Leu-14 y Phe-19 mutados.

11. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula diana es una célula humana, preferentemente seleccionada del grupo que comprende células cancerosas, células artríticas, células vasculares de músculo liso hiperproliferativas y células infectadas con un virus que no sea dicho virus recombinante.

12. Virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para utilizar como un medicamento.

13. Virus recombinante, según la reivindicación 12, para utilizar como un medicamento para suprimir el crecimiento celular no controlado, en particular crecimiento de células malignas, artritis, en particular artritis reumatoide o hiperplasia de células vasculares del músculo liso.

14. Procedimiento in vitro para lisar células diana defectuosas en la vía de apoptosis dependiente de p53, que comprende las etapas de:

infectar dichas células diana con un virus recombinante, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que tiene capacidad lítica en dichas células diana;

replicar dicho virus dentro de dichas células diana, que comprende además la etapa de proporcionar, en el genoma del virus la secuencia de codificación de, como mínimo, una proteína de la vía de apoptosis dependiente de p53, siendo capaz dicha secuencia de codificación de ser expresada en las células diana tras la infección de las mismas por dicho virus y comprende además en el genoma del mismo el gen que codifica la proteína E1B-55 kDa o un mutante de E1B-55kDa capaz de formar un complejo con p53.