Metilación de los promotores de MAL y de CADM1, marcador de diagnóstico molecular para cánceres cervicales invasivos inducidos por el VPH y sus lesiones precursoras de alto grado de malignidad.

Método para la detección de una lesión premaligna cervical inducida por VPH que presenta un grado de neoplasiaintraepitelial cervical (NIC) ³ 2 en un individuo con necesidad del mismo mediante la detección de metilaciónincrementada del promotor de CADM1 y la detección de metilación incrementada del promotor de MAL en célulascervicales.

Metilación de los promotores de MAL y de CADM1, marcador de diagnóstico molecular para cánceres cervicales invasivos inducidos por el VPH y sus lesiones precursoras de alto grado de malignidad

SECTOR DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al sector de la prevención del cáncer y el diagnóstico médico; y se refiere a un marcador de diagnóstico molecular para cánceres invasivos inducidos por el virus del papiloma humano (VPH) y a lesiones precursoras de alto grado de malignidad de los mismos, tales como cáncer cervical invasivo y lesiones cervicales premalignas. En particular, la presente invención se refiere a la utilización de la secuencia genómica y reguladora de MAL o los productos génicos de la misma como marcadores para lesiones premalignas inducidas por VPHhr con potencial invasivo y cánceres invasivos inducidos por VPHhr.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

El cáncer del cuello uterino es el segundo cáncer más común en mujeres a nivel mundial y es responsable de aproximadamente 250.000 muertes por cáncer al año.

El desarrollo del carcinoma cervical de células escamosas se caracteriza por una secuencia de lesiones premalignas, denominadas neoplasia intraepitelial cervical (NIC) , que se clasifican de 1 a 3, refiriéndose a displasia leve (NIC 1) , displasia moderada (NIC 2) y displasia/carcinoma in situ grave (NIC 3) , respectivamente. La NIC 1 también se refiere como lesión intraepitelial escamosa de bajo grado de malignidad (LSIL) y NIC2 y NIC 3 juntas como lesión intraepitelial escamosa de alto grado de malignidad (HSIL) . Para el adenoma cervical, el adenocarcinoma in situ (ACIS) es una lesión precursora establecida. En principio, estas lesiones premalignas son reversibles, aunque cuanto más grave es la lesión, menores son las posibilidades de regresión espontánea. El cáncer cervical es considerado como una enfermedad prevenible, ya que las fases premalignas se pueden detectar mediante citología exfoliativa y tratarse fácilmente cuando sea necesario, con únicamente efectos secundarios menores. El cribado cervical está dirigido al diagnóstico precoz de lesiones cancerosas premalignas de alto grado de malignidad (es decir, NIC 2/3 y adenocarcinoma in situ) y tratables, reduciendo, de este modo, la mortalidad del cáncer cervical invasivo. La práctica médica general comprende el tratamiento de todas las mujeres con NIC 2, NIC 3 y adenocarcinoma in situ, confirmados morfológicamente, a efectos de prevenir el desarrollo del cáncer cervical.

Durante la última década se ha establecido que la carcinogénesis cervical se inicia mediante una infección con el virus del papiloma humano de alto riesgo (VPHhr) . Se ha observado que la expresión de los oncogenes virales E6 y E7, que alteran los mecanismos supresores de los tumores p53 y Rb, respectivamente, es esencial tanto para la aparición de la oncogénesis como para el mantenimiento de un fenotipo maligno. Por lo tanto, el análisis del VPHhr parecía una herramienta atractiva de cribado primario. Sin embargo, en concordancia con un proceso de carcinogénesis de múltiples etapas, se necesitan alteraciones adicionales en el genoma de la célula huésped para la progresión de una célula infectada por VPHhr en una célula cancerosa invasiva. Sólo una pequeña proporción de las mujeres infectadas con VPH de alto riesgo desarrollarán lesiones cervicales premalignas de alto grado de malignidad (NIC 2/3) y, si no se tratan, cáncer cervical. En la mayoría de las mujeres con lesiones cervicales premalignas las lesiones experimentan regresión de manera espontánea. De las mujeres que participan en el cribado basado en la población, aproximadamente el 5-6% presentan un análisis positivo en VPHhr (Bulkmans y otros, Int J Cancer 2004, 110: 94-101) . Sin embargo, solo, como máximo, el 20% de ellas (el 1% de las mujeres participantes) presentan ≥NIC 2/3. Por lo tanto, el cribado primario mediante el análisis de VPHhr estará acompañado de un número sustancial de procedimientos de seguimiento redundantes y una ansiedad innecesaria entre las mujeres, a menos que se puedan aplicar marcadores a los frotis cervicales que permitan la estratificación de mujeres que dieron positivo en VPHhr para el riesgo de ≥NIC 2/3 y ≥adenocarcinoma in situ.

El objetivo principal es reducir el porcentaje de mujeres que dieron positivo en el análisis con respecto a aquellas que presentan lesiones clínicamente significativas. Un modo es utilizar la citología como un análisis secundario (denominado triaje) para las mujeres que dieron positivo en VPHhr. Aún así, esto deja un número sustancial de mujeres que dieron positivo en VPHhr con citología normal (3, 5% de las mujeres en la población del cribado) , de las cuales el 10% presentan o adquieren ≥NIC 3. Además, la citología no es una opción para muestras cervicovaginales tomadas por el propio individuo en casa, ya que éstas no son representativas del estado citológico del cuello uterino (Brink y otros, 2006, J. Clin. Microbiol. 44:2518-2523) . Por lo tanto, existe la necesidad de herramientas de triaje complementarias o alternativas para estratificar mujeres que dieron positivo en VPHhr en aquellas con y sin ≥NIC 2/3 y ≥adenocarcinoma in situ.

El documento WO 2004/087962 da a conocer un método de detección de la metilación del promotor de CADM1 en lesiones cervicales premalignas y malignas. El documento WO 2007/007205 da a conocer un método de detección de la metilación del promotor de MAL en lesiones cervicales premalignas y malignas.

CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN

Los presentes inventores han desarrollado ahora un marcador de diagnóstico (molecular) basado en las alteraciones de MAL, en particular un ARNm y expresión proteica de MAL reducidos, así como la hipermetilación del promotor de MAL, para identificar lesiones precancerosas de alto grado de malignidad inducidas por el virus del papiloma humano (VPH) , tales como lesiones cervicales premalignas de cáncer cervical invasivo, y lesiones precursoras inducidas por el virus de papiloma humano (VPH) de alto riesgo de cánceres no cervicales invasivos en material celular obtenido a través de un raspado, lavado o mediante otro medio y/o tejido. En particular, el presente documento se refiere a la utilización del gen de MAL (incluyendo su promotor) y los productos génicos del mismo, como marcadores de lesiones premalignas de alto grado de malignidad inducidas por VPH, que permiten la detección precoz y una mejor opción de tratamiento para el paciente individual.

De manera sorprendente, se ha descubierto ahora que el gen que codifica la proteína asociada a la maduración de linfocitos T, también conocida como proteína de diferenciación de células T (también referida como MAL; Acceso del Banco de genes NM_002371) está implicado como gen supresor de tumores en la carcinogénesis cervical, y que un nivel bajo de expresión del gen MAL, causado principalmente por la metilación del promotor de MAL, es un factor determinante importante de la carcinogénesis cervical. De este modo, las secuencias genómicas y reguladoras de MAL y los productos génicos de las mismas proporcionan marcadores valiosos para diagnosticar el cáncer cervical invasivo y las lesiones precursoras de alto grado de malignidad del mismo. De manera particular, cuando se combina con el análisis de metilación de CADM1 (Identificación del Banco de genes NM 014333.3) , se consigue una sensibilidad elevada para el cáncer cervical invasivo y las lesiones precursoras de alto grado de malignidad del mismo, que supera a la hallada con una citología cervical. De manera adicional, el presente documento es adecuado para diagnosticar los cánceres invasivos asociados con VPHhr no cervicales y sus lesiones precursoras de alto grado de malignidad.

El cáncer cervical está casi exclusivamente asociado con la infección por el virus del papiloma humano (VPH) . Los virus del papiloma humano constituyen un grupo de más de 100 tipos de virus identificados por las variaciones en la secuencia de ADN. Los diversos VPH causan una variedad de enfermedades cutáneas y de las mucosas. Los VPH se clasifican de manera amplia en tipos de bajo riesgo y alto riesgo, en base a su capacidad de inducir cambios malignos en células infectadas. Los tipos de bajo riesgo de VPH, tales como 1, 2, 4, 6, 11, 13 y 32 están asociados principalmente con lesiones benignas o verrugas comunes, mientras que los tipos de alto riesgo, tales como 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, y 68 están principalmente asociados con lesiones epiteliales premalignas o malignas. Estos tipos de alto riesgo de VPH causan crecimientos que normalmente son lisos y casi invisibles, en comparación con las verrugas causadas por los tipos de bajo riesgo, por ejemplo, VPH-6... [Seguir leyendo]

1. Método para la detección de una lesión premaligna cervical inducida por VPH que presenta un grado de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) ≥ 2 en un individuo con necesidad del mismo mediante la detección de metilación incrementada del promotor de CADM1 y la detección de metilación incrementada del promotor de MAL en células cervicales.

2. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha lesión premaligna cervical inducida por VPH es una lesión premaligna cervical inducida por VPH de alto riesgo. 10

3. Método, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la metilación incrementada se detecta utilizando una endonucleasa de restricción, de manera preferente una endonucleasa de restricción sensible a la metilación.

4. Kit de partes para utilizar en un método de detección de una lesión premaligna cervical inducida por VPH que presenta un grado de neoplasia intraepitelial cervical (NIC) ≥ 2 en células de prueba de un individuo, comprendiendo dicho kit

-medios para la detección de la metilación del promotor de MAL, en el que dichos medios comprenden sondas y/o

cebadores específicos para la secuencia de nucleótidos de MAL de la figura 1; y -medios para la detección de la metilación del promotor de CADM1, en el que dichos medios comprenden sondas y/o cebadores específicos para CADM1; y

- de manera opcional, medios para la detección de la infección por VPH, en el que dichos medios comprenden

sondas y cebadores específicos para VPH. 25

Figura 1: Promotor de MAL, secuencia codificante, secuencia rica en CpG del intrón 1 y 3’UTR

Obtenida de UCSC genome bioinformatice (www.genome.ucsc.edu) Referencia: hg18_knownGene_uc002stx.1 rango = chr2:95054206-95083462

El inicio de la transcripción se indica en negrita. La secuencia codificante está en mayúsculas. La parte del intrón 1, que contiene las secuencias ricas en CpG y que es parte de una isla de CpG más grande que empieza en el promotor (nt375) , está marcada por * y subrayada.