VIRUS DE REPLICACIÓN COMPETENTE CAPACES DE SILENCIAR LA EXPRESIÓN DE UN FACTOR DE INHIBICIÓN DE VIRUS.

Virus de replicación competente capaces de silenciar la expresión de un factor de inhibición de virus. Sector de la invención. La presente invención se refiere a los sectores de la modificación genética, la biotecnología y la medicina. En particular, la presente invención da a conocer adenovirus recombinantes con potencia para lisar las células en las que éstos se replican y suprimir la expresión de uno o más genes diana en dichas células en las que éstos se replican. La presente invención da a conocer además adenovirus recombinantes que silencian la expresión de ciertos genes en determinadas células, lo que provoca que dichos virus se repliquen con más eficacia en dichas células y lisen las mismas. De este modo, la presente invención da a conocer medios más eficaces para erradicar ciertas poblaciones de células. La presente memoria descriptiva da a conocer además métodos y medios para identificar los genes diana cuyo silenciamiento hace que los virus se reproduzcan y lisen las células en las que se replican con mayor eficacia. La presente invención da a conocer además adenovirus recombinantes que silencian la expresión de genes diana identificados en dichas células, lo que provoca que dichos virus se repliquen con más eficacia en dichas células y lisen las mismas. La presente invención tiene aplicaciones útiles en las áreas de producción de vectores virales, la identificación de dianas terapéuticas y tratamientos médicos basados en la inhibición de la expresión de proteínas y la eliminación de ciertas células de un cuerpo, tal como por ejemplo las células cancerosas. Antecedentes de la invención Los virus recombinantes se generan a partir del genoma de virus mediante ingeniería genética. Esta ingeniería genética a menudo implica la inserción de ADN heterólogo en el genoma del adenovirus incluyendo, pero sin constituir limitación, ADN que codifica un producto terapéutico. Sin embargo, debe entenderse que el término virus recombinante pretende incluir además virus de los que se han eliminado partes del genoma del virus sin la inserción de ADN heterólogo. Otro ejemplo de un virus recombinante es un virus quimérico que contiene partes de los genomas de diferentes virus o de diferentes tipos del mismo virus tales como, por ejemplo, virus de serotipo diferente o virus con diferentes especificidades de especies animales huésped. A los efectos de la presente invención, se diferencian dos tipos de virus recombinantes, es decir, virus deficientes en replicación y virus competentes en replicación. La presente invención se refiere únicamente a virus competentes en replicación. En la presente memoria descriptiva, el virus recombinante se ejemplifica por el adenovirus; por lo tanto, el término adenovirus puede reemplazarse por cualquier virus adecuado conocido en la técnica que es capaz de infectar y lisar células diana. Ejemplos que no constituyen limitación de otros virus adecuados son los virus del herpes simple y los virus vacuna. Además, debe entenderse que también en otros términos definidos en la presente memoria descriptiva que contiene el término adenovirus, tales como por ejemplo factor inhibidor de adenovirus, el término adenovirus puede ser reemplazado por cualquier virus adecuado conocido en la técnica que es capaz de infectar y lisar células diana. En la presente memoria descriptiva, se define adenovirus competentes en replicación porque el virus comprende, como parte de su genoma, la función de replicación en la célula diana, en la que la replicación sólo depende de las funciones de replicación proporcionadas por el virus, en combinación con la maquinaria celular endógena de las células diana. Por lo tanto, el genoma de las células diana está libre de cualquiera de los factores que codifican secuencias exógenas que son necesarios para la replicación viral. Estos factores están proporcionados por el genoma del virus competente en replicación. A este respecto, el término exógeno se refiere a que la maquinaria celular (que incluye las secuencias codificantes para la misma), necesaria para la replicación del virus, es el mecanismo presente de forma natural, por ejemplo, que no se ha introducido en las células mediante técnicas de manipulación humanas. Estas últimas se definen como exógenas. El término función de replicación incluye los factores tales como proteínas, codificados por el virus, necesarios para la replicación del virus en las células diana (en adelante referidas además como factores de replicación viral). Dichos factores pueden ser endógenos para dicho virus, pero también pueden ser análogos funcionales codificados por el genoma viral, por ejemplo, en casos en los que el gen que codifica el factor viral endógeno se elimina del genoma viral. Es importante señalar que estos factores son codificados por el genoma viral y no deben ser complementados por factores exógenos codificados en las células diana. Por lo tanto, los virus cuya replicación depende de una o varias funciones de replicación que se han eliminado del virus, pero que se han introducido en la célula diana, se definen como deficientes de replicación y, por lo tanto, no son parte de la presente invención. La presente invención tal como se reivindica se refiere a virus competentes en replicación, es decir, en los que los genes virales que codifican factores de replicación viral, esenciales para la regulación de la replicación del virus en las células diana están presentes en el genoma viral. En un primer tipo de adenovirus competente en replicación no se han eliminado partes del genoma del adenovirus o dichas partes del genoma del adenovirus que se han eliminado no incluyen las partes que son esenciales para, como mínimo, una etapa del ciclo de vida infeccioso del adenovirus. Por lo tanto, este tipo de adenovirus 2 E05732404 04-01-2012   recombinante se define además como un adenovirus competente en replicación genuina que tiene una capacidad para replicarse en células como lo hace el adenovirus parental no modificado. En general, la replicación de los adenovirus se limita a las células de una especie animal particular o grupo particular de especies animales. Por ejemplo, los adenovirus recombinantes derivados de adenovirus humanos sólo pueden transversar un ciclo completo de vida en células humanas, con replicación muy ineficaz que tiene lugar a dosis altas en células de otras especies. Un segundo tipo de adenovirus competente en replicación es el denominado adenovirus de replicación condicional (CRAd, de Conditional Replicating Adenovirus). En los CRAd se han eliminado una o más partes del genoma del adenovirus, incluyendo partes que son esenciales, como mínimo, para una etapa del ciclo de vida infeccioso del adenovirus en ciertas condiciones fisiológicas (en la presente memoria descriptiva, en adelante también primeras condiciones), pero no en ciertas otras condiciones fisiológicas (en la presente memoria descriptiva, en adelante también segundas condiciones). Dichas primeras y segundas condiciones podrían, por ejemplo, estar dictadas por las condiciones fisiológicas que existen en un tipo particular de células (en la presente memoria descriptiva, en adelante también primeras células), pero no en otro tipo de células (en la presente memoria descriptiva, en adelante también segundas células). Un primer tipo de células es, por ejemplo, una célula obtenida a partir de un tipo particular de tejido, en el que dicha célula contiene una proteína que no está presente en células de otros tejidos, o lo está en una cantidad mucho menor (segundo tipo de células). Un ejemplo de un segundo tipo de células es una célula que ha perdido el control adecuado del crecimiento celular, tal como por ejemplo una célula cancerosa, en la que dicha célula o bien carece de una proteína que está presente en las células que no han perdido el control adecuado del crecimiento celular, o bien en la que dicha célula ha ganado la expresión (o sobreexpresión) de una proteína que no está presente en las células que no han perdido el control adecuado del crecimiento celular o está presente en una cantidad mucho menor. Otro ejemplo de dichas segundas condiciones son las condiciones que existen en una determinada fase del ciclo celular o en una etapa particular del desarrollo de la célula, en la que se expresa específicamente una proteína particular. De este modo, los CRAd pueden diseñarse de tal forma, que la replicación de los mismos se activa en células específicas, tales como las células cancerosas o un tipo particular de células cancerosas, mientras que en las células normales, la replicación de los CRAd no es posible. Esto se conoce en la técnica, y se revisa por ejemplo por Heise y Kirn, J. Clin. Invest. 105 (2000): 847-851; Alemany y otros, Nat. Biotech. 18 (2000): 723-727; Gómez-Navarro y Curiel,... [Seguir leyendo]

1. Adenovirus competente en replicación capaz de replicarse y tener capacidad lítica en células diana, comprendiendo el virus en el genoma del mismo, como mínimo, una secuencia de ADN que codifica una molécula de ARN de interferencia funcional en la reducción de la expresión de un gen diana que codifica un factor inhibidor de adenovirus en dicha células diana, unido operativamente a una o más secuencias de control de la expresión, funcionales en dichas células diana, en el que el factor inhibidor de adenovirus es un antagonista de p53. 2. Adenovirus competente en replicación, según la reivindicación 1, en el que la molécula de ARN de interferencia comprende un ARN de doble cadena. 3. Adenovirus competente en replicación, según la reivindicación 2, en el que la longitud de la doble cadena comprende, como mínimo, 19 nucleótidos y menos de 30 nucleótidos por cadena. 4. Adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha molécula de ARN de interferencia comprende un ARN horquilla. 5. Adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que dicho adenovirus es un adenovirus humano. 6. Adenovirus competente en replicación, según la reivindicación 5, en el que el adenovirus es un adenovirus de replicación condicional. 7. Adenovirus competente en replicación, según la reivindicación 6, en el que el adenovirus porta una mutación en la región E1A que abarca, como mínimo, una parte del dominio CR2 de E1A, preferentemente una deleción que abarca los aminoácidos 122 a 129 (LTCHEAGF) de E1A. 8. Adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el genoma del virus comprende adicionalmente la secuencia de codificación, como mínimo, de p53 funcional en la restauración de la ruta de apoptosis dependiente de p53 en dichas células diana, unida operativamente a una o más secuencias de control de la expresión, funcionales en dichas células diana. 9. Adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el factor inhibidor de adenovirus se selecciona del grupo que comprende MDM2, Pirh2, COP1, Bruce, VPH-E6, virus del herpes-8 LANA, Parc, Mortalina, Plk-1 y p73DeltaN. 10. Adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que las células diana son células humanas, seleccionadas preferentemente del grupo que comprende células cancerosas, células artríticas o células vasculares del músculo liso. 11. Utilización de un adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en un medicamento. 12. Utilización, según la reivindicación 11, para la fabricación de un medicamento para suprimir el crecimiento celular descontrolado, en particular el crecimiento de células malignas. 13. Método para lisar células diana que expresan un factor inhibidor de adenovirus, que comprende las etapas de: - infectar dichas células diana in vitro con un adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que tiene capacidad lítica en dichas células diana, - replicar dicho adenovirus dentro de dichas células diana, comprendiendo adicionalmente la etapa de proporcionar, en el genoma del adenovirus, como mínimo, una secuencia de ADN que codifica un factor de silenciamiento, funcional en reducir la expresión de dicho factor inhibidor de adenovirus en dichas células diana, siendo dicha, como mínimo, una secuencia de ADN capaz de expresarse en las células diana tras la infección de las mismas por dicho adenovirus, en el que dicho factor inhibidor de adenovirus es un antagonista de la p53. 14. Método, según la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la etapa de someter dichas células diana a irradiación, a un compuesto químico tóxico, a una molécula que inhibe una interacción proteína-proteína o que inhibe una ruta de señalización, a una proteína, entre las que se incluyen sin que constituyan limitación, un anticuerpo, una proteína proapoptótica, una proteína antiangiogénica, y una proteína fusogénica de membrana, o de introducir un gen que codifica dicha proteína que está unido operativamente a una o más secuencias de control de la expresión funcionales en dichas células diana. 15. Utilización de un adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para lisar dichas células diana después de la infección de dichos virus en dichas células diana y la replicación de los mismos. 32 E05732404 04-01-2012   16. Adenovirus competente en replicación, según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su utilización en el tratamiento del cuerpo de un individuo que padece una enfermedad seleccionada del grupo que comprende cáncer, artritis, en particular artritis reumatoide, e hiperplasia celular del músculo liso vascular. 33 E05732404 04-01-2012   34 E05732404 04-01-2012   E05732404 04-01-2012   36 E05732404 04-01-2012   37 E05732404 04-01-2012   38 E05732404 04-01-2012   39 E05732404 04-01-2012