Método de cribado.

Un método in vitro para reducir la transcripción de TCF, y dicho método comprende reducir la actividad de Trabid.

Método de cribado

Campo de la Invención

La invención se refiere a la ruta de señalización de Wnt y a los trastornos asociados a defectos en esa ruta. En particular, la invención se refiere a la señalización de poliposis adenomatosa coli (APC) y a la mejora o reducción de los efectores de la misma en el tratamiento de trastornos tales como el cáncer colorrectal.

Antecedentes de la Invención

Se ha demostrado que la señalización de Wnt es importante en el cáncer. De hecho, la señalización de Wnt está implicada en la promoción de tumores y el cáncer por medio de defectos genéticos en numerosos niveles o etapas de la ruta. Este tema es revisado con detalle por Polakis (2000 Genes and Development, vol. 14, páginas 18371851) .

La poliposis adenomatosa coli (APC) tiene un papel primordial en la ruta de señalización de Wnt. APC es un supresor tumoral importante cuya función se pierde en la mayoría de los cánceres colorrectales esporádicos y hereditarios. Su función más conocida es la inhibición de º-catenina, un efector clave de la ruta de señalización de Wnt. Además, las proteínas APC parecen tener también una función diferente en el mantenimiento de la adhesión celular mediada por cadherina, y la pérdida de esta función podría acelerar la transición de los tumores hasta una neoplasia maligna invasiva.

APC está inactivado en más del 80% de todos los cánceres colorrectales. El gen APC es defectuoso en la poliposis adenomatosa familiar (FAP) , una enfermedad heredada de manera dominante que predispone a los tumores colorrectales. La inactivación de APC se observa también en la mayoría de tumores esporádicos, y es un suceso temprano, y posiblemente iniciador, en la tumorigénesis.

APC es un regulador negativo de la ruta de señalización de Wnt. Se une y favorece la inhibición de º-catenina, un efector clave de esta ruta. En las células en las que esta ruta es inactiva, la º-catenina se degrada rápidamente, como resultado de la fosforilación en su extremo N-terminal proporcionada por el complejo de destrucción Axin que también contiene glucógeno sintasa quinasa 3º. En la señalización de Wnt, la º-catenina se estabiliza y se transloca al núcleo donde se une a los factores TCF/LEF para activar la transcripción de los genes objetivo de Wnt. Se cree que estos cambios en la transcripción son la base de la tumorigénesis. Así, es un problema controlar la transcripción de los genes objetivo de Wnt, o atenuar su expresión.

Las pruebas actuales sugieren que APC, como º-catenina, pueden tener además una función diferente en la adhesión celular. Estas pruebas surgieron del trabajo en Drosophila, en la que el pariente de APC, E-APC, está asociado a las uniones adherentes en los epitelios, y parece afectar a la adhesión celular. Están surgiendo pruebas de que esto también es aplicable a las células humanas: el supresor tumoral APC se asocia con las membranas adhesivas laterales en diversas células polarizadas de mamíferos, y se ha implicado en el intercambio de º-catenina en las uniones adherentes y en la adhesión celular de las células de cáncer colorrectal. Estos hallazgos son potencialmente relevantes con respecto a la progresión tumoral, ya que la pérdida de la adhesión mediada por cadherina acompaña a menudo a la transición de los tumores benignos hasta carcinomas invasivos. Así, es un problema estimular o mantener la adhesión celular, tal como la adhesión mediada por cadherina.

El dominio más conservado de las proteínas APC es su Dominio de Repeticiones de Armadillo (ARD) N-terminal, un supuesto dominio de interacción con proteínas. Los parientes más cercanos de este dominio se hallan en º-catenina y a-importina; las funciones y estructuras de estos ARDs se conocen bien, lo que incluye las interacciones moleculares precisas con muchos de sus ligandos funcionalmente relevantes. En contraste, es un problema en la técnica que exista un entendimiento escaso de la función molecular del ARD de las proteínas APC, y aunque ha habido informes de ligandos supuestos, su importancia funcional con respecto a APC todavía está poco clara o se desconoce.

La presente invención busca superar el/los problema (s) asociado (s) con la técnica anterior.

Sumario de la Invención

Los presentes inventores han descubierto una proteína nueva que interacciona de una manera biológicamente significativa con la proteína APC. Se ha aislado esta proteína basándose en su capacidad de interaccionar con la proteína de tipo natural, pero no con una proteína APC mutante de repeticiones del ARD. La proteína identificada es Trabid. La proteína Trabid no tiene ninguna función biológica descrita en la técnica anterior. Así, se ha atribuido un papel de señalización completamente nuevo y biológicamente importante a esta proteína en el presente trabajo.

Además, Trabid se ha caracterizado bioquímicamente. Se ha identificado que Trabid es una nueva enzima desubiquitilasa. El dominio de unión de ubiquitina se ha definido y se ha demostrado experimentalmente. Trabid tiene especificidad de unión por la ubiquitina unida por K63, que se ha definido y se ha demostrado experimentalmente. Esta actividad es necesaria para la actividad de la ruta de Wnt en el cáncer colorrectal o en las células estimuladas por Wnt. La actividad desubiquitilasa se ha definido y se ha demostrado experimentalmente. Además, los efectos de la manipulación de Trabid (en particular la inhibición y/o reducción) y el uso de inhibidores de Trabid se ha demostrado que abarcan la modulación de efectores de Wnt biológicamente importantes en líneas de células humanas con señalización de Wnt activada, así como en líneas de células colorrectales. Así, se ha establecido por primera vez una relación funcional entre Trabid y la señalización de Wnt/transcripción mediada por TCF.

La invención se basa en estos hallazgos notables.

La invención proporciona un método para reducir la transcripción de TCF, y dicho método comprende reducir la actividad de Trabid. Preferiblemente, la actividad de Trabid se reduce mediante el uso de siARN hacia Trabid o mediante el uso de Trabid negativo dominante. Cuando se usa Trabid negativo dominante, se introduce en el sistema en el que se desea reducir la actividad de Trabid, por ejemplo mediante el suministro del polipéptido Trabid negativo dominante, o mediante la expresión de un ácido nucleico que codifica el mismo (es decir, mediante la introducción de dicho ácido nucleico en dicho sistema mediante cualquier medio conocido en la técnica) . Preferiblemente, dicha expresión de TCF no es una transcripción estimulada por la fusión º-catenina-Lef. Preferiblemente, dicha transcripción de TCF es una transcripción de TCF estimulada por Dvl, estimulada por Wnt3A, estimulada por LiCl, o estimulada por m -TrCp-LF. Preferiblemente, dicha transcripción de TCF es una transcripción de TCF estimulada por Dvl. Preferiblemente, dicha actividad de TCF es una actividad de TCF estimulada por la mutación de APC o por la pérdida y/o por la activación de beta-catenina. Estas aplicaciones específicas se demuestran en la sección de ejemplos, p.ej. con referencia a la línea de células de cáncer SW480 mutantes para APC, y la línea de células de cáncer HCT116 mutantes para beta-catenina (como se muestra en las figuras) , las cuales dependen de la actividad de Trabid.

En otro aspecto, la invención se refiere a un método de inhibición de la transcripción de TCF que comprende la inhibición o regulación a la baja de Trabid.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento de la poliposis adenomatosa familiar en un sujeto, que comprende modular la señalización de Trabid en dicho sujeto.

En otro aspecto, la invención proporciona un método de tratamiento del cáncer colorrectal en un sujeto, que comprende modular la señalización de Trabid en dicho sujeto. Las referencias al cáncer colorrectal incluyen de manera adecuada el cáncer de colon.

Preferiblemente, la modulación de Trabid es la inhibición de Trabid.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de Trabid en la desubiquitilación, preferiblemente el uso de Trabid para eliminar un resto de ubiquitina de un polipéptido, preferiblemente el uso de Trabid en la desubiquitilación de un polipéptido.

La desubiquitilación significa la eliminación de una o más unidades de ubiquitina de un polipéptido que comprende las mismas. Dependiendo de dónde tiene lugar la escisión para la eliminación, las unidades liberadas pueden corresponder a unidades de ubiquitina completas, cadenas de poliubiquitina, o fragmentos de ubiquitina. Preferiblemente, se liberan unidades de ubiquitina completas.... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para reducir la transcripción de TCF, y dicho método comprende reducir la actividad de Trabid.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que la actividad de Trabid se reduce mediante el uso de siARN hacia Trabid.

3. Un método según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicha transcripción de TCF es una transcripción de TCF estimulada por Dvl, estimulada por Wnt3A, estimulada por LiCl, estimulada por la pérdida o la mutación de APC, estimulada por la activación o la mutación de beta-catenina o estimulada por mº-TrCp-LF.

4. El uso de Trabid en la desubiquitilación de un polipéptido, en el que Trabid comprende al menos el dominio de tumor ovárico (OTU) C-terminal que comprende al menos los aminoácidos 355 a 708 de Trabid, en el que el uso no da como resultado un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia y métodos de diagnóstico puestos en práctica en el cuerpo humano o animal.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que la desubiquitilación comprende la escisión de ubiquitina K63.

6. El uso según la reivindicación 4, en el que Trabid comprende además los motivos de dedos NZF N-terminales.

7. El uso según la reivindicación 4, en el que Trabid comprende los aminoácidos 1 a 708 del polipéptido Trabid humano de longitud completa.

8. El uso de un inhibidor de Trabid para la fabricación de un medicamento para el cáncer colorrectal, en el que dicho inhibidor de Trabid es siARN hacia Trabid o es Trabid C443S.

9. El uso de un inhibidor de Trabid para la fabricación de un medicamento para la poliposis adenomatosa familiar, en el que dicho inhibidor de Trabid es siARN hacia Trabid o es Trabid C443S.

10. Un inhibidor de Trabid para el uso en el tratamiento del cáncer colorrectal, en el que dicho inhibidor de Trabid es siARN hacia Trabid o es Trabid C443S.

11. Un inhibidor de Trabid para el uso en el tratamiento de la poliposis adenomatosa familiar, en el que dicho inhibidor de Trabid es siARN hacia Trabid o es Trabid C443S.

12. El uso de Trabid en la precipitación de un polipéptido que comprende ubiquitina.

13. Un método para la identificación de un modulador de Trabid, y dicho método comprende

(i) proporcionar un sustrato de Trabid que comprende un resto detectable acoplado a un resto marcador mediante ubiquitina

(ii) inmovilizar la primera y segunda porciones de dicho sustrato

(iii) añadir un modulador candidato a dicha primera porción

(iv) poner en contacto dichas primera y segunda porciones con Trabid

(v) incubar para permitir la acción de Trabid, y

(vi) ensayar la escisión de la ubiquitina mediante la separación del marcador del resto detectable,

en el que la separación de una cantidad de resto detectable de dicha primera porción que es diferente de la cantidad de resto detectable separada de dicha segunda porción identifica a dicho candidato como un modulador de Trabid.

Dominio HD2 marcado con S

Transcripción dependiente de TCF (estimulación en proporción)

Transcripción dependiente de TCF (estimulación en proporción)

Transfección de ADN: