Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN.

ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos aislado que media en la interferencia por ARN de un ARNm al quecorresponde,

con la condición de que el ARN bicatenario no sea ucg age ugg acg gcg acg uaa, unido químicamenteen el extremo 3' al extremo 5' del ARN complementario mediante un grupo ligador C18.

Mediadores de interferencia por ARN específicos de secuencias de ARN

Antecedentes de la invención La interferencia por ARN o “iARN” es un término inicialmente acuñado por Fire y colaboradores para describir la observación de que el ARN bicatenario (ARNbc) puede bloquear la expresión génica cuando se introduce en gusanos (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811) . El ARNbc dirige el silenciamiento postranscripcional, específico de genes en muchos organismos, incluyendo vertebrados, y ha proporcionado una nueva herramienta para el estudio de la función génica. La iARN implica la degradación del ARNm, pero se desconocen muchos de los mecanismos bioquímicos subyacentes a esta interferencia. Se necesita la recapitulación de las características esenciales de la iARN in vitro para el análisis bioquímico del fenómeno.

Sumario de la invención La invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas,

En el presente documento se describe una interferencia mediada por ARNbc específico de genes, en un sistema libre de células derivado del blastodermo sincitial de embriones de Drosophila. El sistema in vitro complementa enfoques genéticos para analizar minuciosamente la base molecular de la iARN. Como se describe en el presente documento, se examinaron los mecanismos moleculares subyacentes a la iARN usando el sistema in vitro de Drosophila. Los resultados mostraron que la iARN es dependiente de ATP aunque desacoplado de la traducción del ARNm. Es decir, no se requiere la síntesis de proteínas para la iARN in vitro. En la reacción de iARN, ambas cadenas (sentido y antisentido) del ARNbc se procesan dando lugar a fragmentos o segmentos pequeños de ARNbc de aproximadamente 21 a aproximadamente 23 nucleótidos (nt) de longitud (los ARN con movilidad en geles de secuenciación que corresponden a marcadores que son de 21-23 nt de longitud, denominado opcionalmente en lo sucesivo ARNbc de 21-23 nt) . El procesamiento del ARNbc en fragmentos pequeños de ARN no requiere el ARNm seleccionado como diana, lo que demuestra que las especies pequeñas de ARN se generan mediante el procesamiento del ARNbc y no como un producto de degradación de ARNm dirigida por ARNbc. El ARN sólo se escinde dentro de la región de identidad con el ARNbc. La escisión se produce en sitios separados en 21-23 nucleótidos, el mismo intervalo observado para el propio ARNbc, lo que sugiere que los fragmentos de 21-23 nucleótidos del ARNbc guían la escisión del ARNm. Esos ARN purificados de 21-23 nt que median en la iARN confirman que estos fragmentos guían la escisión del ARNm.

Por consiguiente, la presente invención se refiere a moléculas de ARN bicatenario (bc) aisladas desde 21 hasta 23 nucleótidos que median en la iARN. Es decir, los ARN aislados de la presente invención median en la degradación de ARNm de un gen al que corresponde el ARN (median en la degradación del ARNm que es el producto transcripcional del gen, que también se denomina en lo sucesivo gen diana) . Por conveniencia, tal ARNm también se denomina en lo sucesivo en el presente documento ARNm que va a degradarse. El ARN bicatenario puede ser ARN parcialmente purificado, ARN esencialmente puro, ARN sintético o ARN producido de forma recombinante, Los nucleótidos en las moléculas de ARNbc de la presente invención pueden comprender también nucleótidos no convencionales, incluyendo nucleótidos que no se producen de manera natural o desoxirribonucleótidos. Colectivamente, todos los ARN alterados se denominan en lo sucesivo análogos o análogos de ARN que se producen de manera natural. El ARNbc de 21-23 nucleótidos de la presente invención sólo necesita ser suficientemente similar al ARN natural que tiene la capacidad para mediar (media) en la iARN. Como se usa en el presente documento, la expresión “media en la iARN” se refiere a (indica) la capacidad para distinguir que ARN van a degradarse mediante el maquinaria o proceso de la iARN. El ARN que media en la iARN interactúa con la maquinaria de la iARN de tal manera que dirige la maquinaria para degradar un ARNm particular. En una realización, se describen en el presente documento moléculas de ARN de 21 a 23 nucleótidos que dirigen la escisión del ARNm específico al que corresponde su secuencia. No es necesario que la correspondencia de las secuencias sea perfecta, sino que la correspondencia debe ser suficiente para permitir que el ARN dirija la escisión por iARN del ARNm diana. En una realización particular, las moléculas de ARNbc de 21-23 nt comprenden un grupo hidroxilo en 3’.

La presente divulgación también se refiere a procedimientos para producir moléculas de ARNbc de 21 a 23 nucleótidos con capacidad para mediar la escisión por iARN. En una realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila. En esta realización, se combina el ARNbc con un extracto soluble derivado de embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARNbc se procesa para dar moléculas de ARNbc de 21 a 23 nucleótidos. En otra realización, se usa el sistema in vitro de Drosophila para obtener secuencias de ARNbc de 21-23 nucleótidos que median en la interferencia por ARN del ARNm de un gen particular (por ejemplo, oncogén, gen viral) . En esta realización, el ARN bicatenario que corresponde a una secuencia del gen que va seleccionarse como diana se combina con un extracto soluble derivado del embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a ARN de 21 a 23 nucleótidos de longitud. Como se muestra en el presente documento, el ARNbc de 21-23 nt media en el ARN del ARNm del gen seleccionado como diana (el gen cuyo ARNm va a degradarse) . El procedimiento para obtener los ARNbc de 21-23 nt utilizando el sistema in vitro de Drosophila además puede comprender aislar la secuencia de ARN de la combinación.

La presente invención también se refiere a ARNbc de 21-23 nt producido mediante los procedimientos de la presente divulgación, así como los ARNbc de 21-23 nt, producidos mediante otros procedimientos, tales como 5 síntesis química o técnicas de ADN recombinante, que tienen las mismas o substancialmente las mismas secuencias que los ARN producidos de manera natural que median en la iARN, tales como los producidos mediante los procedimientos de la presente invención. Todos estos se denominan en lo sucesivo ARNbc de 21-23 nt que median en la interferencia por ARN. Como se usa en el presente documento, el término ARN aislado incluye el ARN obtenido mediante cualquier medio, incluyendo el procesamiento o escisión del ARNbc como se describe en el

presente documento; la producción mediante procedimientos de síntesis química; y la producción mediante técnicas de ADN recombinante. La invención también se refiere a usos de los ARNbc de 21-23 nt, tales como para el tratamiento terapéutico o profiláctico y composiciones que comprenden los ARNbc de 21-23 nt que median la iARN, tales como composiciones farmacéuticas que comprenden los ARNbc de 21-23 nt y un vehiculo apropiado (por ejemplo, un tampón o agua) .

La presente divulgación también se refiere a un procedimiento para mediar en la interferencia por ARN del ARNm de un gen en una célula o en el organismo (por ejemplo, un mamífero tal como un ratón o un ser humano) . En una realización, se introduce el ARNbc de 21-23 nt que se dirige al ARNm que va a degradarse en la célula o el organismo. La célula o el organismo se mantienen en las condiciones en que se produce la degradación del ARNm, mediando de este modo la interferencia por ARN del ARNm del gen en la célula o el organismo. La célula o el

organismo puede ser uno en que se produce la iARN cuando se obtiene la célula o el organismo, o una célula o un organismo puede ser uno que se ha modificado de modo que se produzca la iARN (por ejemplo, mediante la adición de componentes obtenidos de una célula o extracto celular que median en la iARN o la activación de componentes endógenos) . Como se usa en el presente documento, la expresión “célula u organismo en que se produce la iARN” incluye tanto una célula como un organismo en que se produce la iARN cuando se obtiene la célula o el organismo,

o una célula o un organismo que se han modificado de modo que se produzca la iARN. En otra realización, el procedimientos para mediar en la interferencia por ARN de un gen en una célula comprende combinar el ARN bicatenario que corresponde a una secuencia del gen con un extracto soluble derivado del embrión de Drosophila, produciendo de este modo una combinación. La combinación se mantiene en condiciones en las que el ARN bicatenario se procesa para dar lugar a... [Seguir leyendo]

1. ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos aislado que media en la interferencia por ARN de un ARNm al que corresponde, con la condición de que el ARN bicatenario no sea ucg age ugg acg gcg acg uaa, unido químicamente en el extremo 3’ al extremo 5’ del ARN complementario mediante un grupo ligador C18.

2. El ARNbc aislado de la reivindicación 1 que comprende un grupo hidroxilo terminal en 3’.

3. El ARNbc aislado de la reivindicación 1 que es ARN sintético o comprende nucleótidos no naturales.

4. El ARNbc aislado de 21 a 23 nucleótidos que dirige la escisión del ARNm específico al que corresponde su secuencia, con la condición de que el ARN bicatenario no sea ucg age ugg acg gcg acg uaa, unido químicamente en el extremo 3’ al extremo 5’ del ARN complementario mediante un grupo ligador C18.

5. El ARN bicatenario de 21 a 23 nucleótidos para su uso en un procedimiento de tratamiento de una enfermedad o afección asociada con la presencia de una proteína en un individuo, que comprende administrar al individuo ARNbc de 21 a 23 nucleótidos que dirige el ARNm de la proteína para su degradación.

6. El ARNbc para su uso en el procedimiento de la reivindicación 5, en el que el ARNbc de 21 a 23 nucleótidos es ARN sintético o comprende nucleótidos no naturales.

7. Una composición farmacéutica que comprende ARNbc de 21 a 23 nucleótidos que media la interferencia por ARN y un vehículo adecuado, con la condición de que el ARN bicatenario no sea ucg age ugg acg gcg acg uaa, unido químicamente en el extremo 3’ al extremo 5’ del ARN complementario mediante un grupo ligador C18.

8. Uso de ARNbc de la reivindicación 1 a 5, para inactivar específicamente la función génica in Vitro a condición de que el ARN bicatenario no sea ucg age ugg acg gcg acg uaa, unido químicamente en el extremo 3’ al extremo 5’ del 20 ARN complementario mediante un grupo ligador C18.

9. Un procedimiento ex vivo de tratamiento de células de un individuo para degradar un gen que cause o esté asociado con una enfermedad o afección indeseable, comprendiendo el procedimiento obtener células del individuo e introducir en las células el ARN bicatenario d.

2. 23 nt que media en la degradación del ARNm correspondiente.