Matrices de glucano sobre portaobjetos de vidrio revestidos con aluminio de tipo PTFE y métodos relacionados.

Una matriz de carbohidratos inmovilizados en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o unsustrato sólido no transparente revestido con aluminio polifluorado (de tipo politetrafluoroetileno (PTFE)),

comprendiendo la matriz:

una pluralidad de carbohidratos inmovilizados en localizaciones específicas en una superficie del sustrato sólidono transparente revestido con aluminio, de modo que:

(a) los carbohidratos inmovilizados pueden caracterizarse por espectroscopia de masas (EM) y

(b) puede realizarse análisis de reacciones de unión entre los carbohidratos y moléculas que se sospechaque se unen específicamente con los carbohidratos,

donde el aluminio se usa para revestir un primer sustrato sólido transparente a un grosor mayor de 100 nm paraconvertir el primer sustrato sólido transparente en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o unsustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE polifluorado y

donde la superficie del revestimiento de aluminio en el sustrato sólido se anodiza para formar una capa de óxidode aluminio porosa de un grosor menor de 5 nm.

Matrices de glucano sobre portaobjetos de vidrio revestidos con aluminio de tipo PTFE y métodos relacionados

Antecedentes Las matrices de glucano sobre nuevos portaobjetos de vidrio revestidos con aluminio, incluyen portaobjetos de vidrio revestidos con aluminio poli-fluorofosfonado, permiten la caracterización por espectrometría de masas sin matriz, la evaluación de la fluorescencia de unión azúcar-proteína y la identificación y estudio de enzimas con diferente eficiencia y especificidad.

Según la base de datos de proteínas SWISS-PROT, se pronostica que más del 50 % de las proteínas humanas están glucosiladas. A menudo los carbohidratos existen en las superficies celulares como glucoproteínas o 15 conjugados glucolipídicos y desempeñan importantes funciones estructurales y funcionales en numerosos procesos de reconocimiento biológico, por ejemplo, plegamiento, secreción y estabilización de proteínas, infección viral y bacteriana, metástasis de cáncer, respuesta inflamatoria, inmunidad innata y adaptativa y muchos otros procesos de señalización mediados por receptores. Además, existen muchos ejemplos en los que para realizar actividades biológicas se requiere glucosilación. Adicionalmente, muchos organismos, tales como plantas sésiles, han desarrollado mecanismos de glucosilación específicos para desintoxicar xenobióticos exógenos y dañinos.

A pesar del mayor conocimiento del significado biológico de los carbohidratos, el estudio de interacciones carbohidrato-proteína aún entraña mucha dificultad, principalmente debido a la complejidad estructural y a la dificultad sintética de los carbohidratos y a la baja afinidad de sus interacciones con proteínas de unión a glucano (GBP) . Típicamente, la constante de disociación (KD) monomérica en una interacción carbohidrato-proteína está en el intervalo milimolar; por tanto, las respuestas biológicas mediadas por carbohidratos a menudo se realizan a través de interacciones multivalentes sobre la superficie celular para conseguir alta afinidad y especificidad.

Un reto principal en la biología celular es definir la interacción de los oligosacáridos y proteínas implicados en muchos procesos biológicos. Sin embargo, es difícil obtener oligosacáridos puros y existe una necesidad de desarrollar métodos muy sensibles y a alto rendimiento para estudios de identificación y de unión de carbohidratos reconocidos por diversos receptores.

Las micromatrices de carbohidratos son una herramienta poderosa para el estudio de la glucobiología en el

bioensayo a alto rendimiento de enfermedades epidémicas. Un problema fundamental de esta tecnología es cómo caracterizar y cuantificar los oligosacáridos que se unen covalentemente a la superficie. La inmovilización eficaz de azúcar sobre la superficie es esencial para la supervivencia consecutiva al lavado del sustrato cuando se evalúa la unión de azúcar-proteína. Se ha descrito que la espectrometría de masas (EM) es un método analítico útil para la caracterización a alto rendimiento de azúcares inmovilizados sobre portaobjetos de vidrio poroso.

Aunque se dispone de diversos sustratos en el comercio para matrices de glucano, éstos no son adecuados para realizar análisis de espectrometría de masas directo. Estos sustratos incluyen vidrio y polietilentereftalato (PET) recubiertos con grupos amina, carboxilato, N-hidroxisuccinimida (NHS) , avidina, epoxi, aldehído y quelantes de níquel y etcétera. De hecho, los portaobjetos de vidrio funcionalizados con NHS se usan normalmente para la 45 preparación de matrices de glucano. Un ejemplo típico es el de antígenos de azúcar inmovilizados sobre la superficie del portaobjetos de vidrio, después de lo cual un anticuerpo monovalente de unión a azúcar y un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia se incuban para estudios de interacción proteína-carbohidrato. Aunque eficaces, estos portaobjetos de vidrio no son ideales para su uso para caracterizar los azúcares unidos por espectrometría de masas.

Los sustratos seleccionados para EM de desorción-ionización por láser asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF) deben ser conductores o semiconductores de manera que se produzca un campo eléctrico uniforme a alto vacío. Las placas de acero inoxidable convencionales son normalmente la elección para cargar los analitos.

En la EM MALDI, la energía del rayo láser pulsátil se absorbe por la matriz (productos químicos orgánicos miscibles) para impedir la fragmentación de la muestra. La EM MALDI-TOF es una herramienta excelente para analizar biomoléculas de alto peso molecular. Sin embargo, los productos químicos en la matriz orgánica interfieren con oligosacáridos de bajo peso molecular (típicamente menor de 2000 Da) ; por tanto como sustrato se selecciona silicio poroso para el análisis de biomoléculas por EM sin la adición de compuestos químicos de matriz. En la EM de 60 desorción-ionización sobre silicio (DIOS) , se identificaron biomoléculas de peso molecular relativamente bajo en base a la proporción m/z del pico pseudoaparente de EM.

El documento US2004259142 desvela una matriz de moléculas de carbohidrato reductoras marcadas terminalmente inmovilizadas en un soporte.

El documento WO2006055925 desvela el uso micromatrices para investigar las especificidades de unión de carbohidratos de bacterias, para detectar patógenos y para explorar agentes terapéuticos contra la adhesión. El documento US2005221337 desvela una matriz que comprende una pluralidad de aplicaciones sobre un soporte sólido, en el que cada aplicación comprende independientemente un sustrato unido a dicho soporte sólido, en el que cada sustrato unido a dicho soporte sólido es independientemente una molécula que contiene carbohidrato.

El documento EP1208909 desvela un soporte de micromatriz biomolecular para soluciones de aplicación que contienen biomoléculas sonda sobre la superficie e inmovilización de las biomoléculas sonda en las soluciones hacia la superficie, en el que una pluralidad de aplicaciones que pueden unirse a las biomoléculas sonda de pequeño tamaño se disponen en matrices en una disposición regular sobre la superficie del soporte.

Chiari M et al.: J. Chromatogr. B.; 866; 1-2 (2008) desvelan ejemplos de moléculas invitadas en solución entre reconocimiento molecular mediado por polímeros y moléculas huésped localizadas en la fase sólida.

Sumario La presente invención proporciona lo siguiente:

(1) Una matriz de carbohidratos inmovilizada sobre un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio (de tipo politetrafluoroetileno (PTFE) ) polifluorado, comprendiendo la matriz:

una pluralidad de carbohidratos inmovilizados en localizaciones específicas sobre una superficie del sustrato sólido no transparente revestido con aluminio, de tal manera que:

(a) los carbohidratos inmovilizados pueden caracterizarse por espectroscopía de masas (EM) , y

(b) puede realizarse análisis de reacciones de unión entre los carbohidratos y las moléculas que presuntamente se unen específicamente a los carbohidratos,

en la que el aluminio se reviste sobre un primer sustrato sólido transparente a un espesor mayor de 100 nm para convertir el primer sustrato sólido transparente en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE polifluorado, y en el que la superficie del revestimiento de aluminio sobre el sustrato sólido está anodizada para formar una capa porosa de óxido de aluminio de un espesor menor de 5 nm.

(2) La matriz de (1) , en la que el sustrato es conductor o semiconductor de un campo eléctrico.

(3) La matriz de (1) , en la que el sustrato sólido transparente es vidrio.

(4) La matriz de (1) , en la que el carbohidrato es un glucano.

(5) La matriz de (1) , en la que los carbohidratos están inmovilizados mediante un enlace no covalente o mediante un enlace covalente.

(6) La matriz de (5) , en la que los carbohidratos están polifluorados con una cola -CnF2n+1 (n>=4) .

(7) La matriz de (6) , en la que los carbohidratos polifluorados se aplican sobre la superficie del sustrato sólido transparente revestido con aluminio de tipo PTFE.

(8) La matriz de (5) , en el que los carbohidratos se modifican con un grupo funcional de ácido fosfónico, en el que los carbohidratos fosfonilados se inmovilizan sobre la superficie del sustrato por una interacción quelante entre el grupo de ácido fosfónico y el óxido de aluminio sobre la superficie del sustrato sólido transparente revestido con aluminio; o en el que... [Seguir leyendo]

1. Una matriz de carbohidratos inmovilizados en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio polifluorado (de tipo politetrafluoroetileno (PTFE) ) , 5 comprendiendo la matriz:

una pluralidad de carbohidratos inmovilizados en localizaciones específicas en una superficie del sustrato sólido no transparente revestido con aluminio, de modo que:

(a) los carbohidratos inmovilizados pueden caracterizarse por espectroscopia de masas (EM) y

(b) puede realizarse análisis de reacciones de unión entre los carbohidratos y moléculas que se sospecha que se unen específicamente con los carbohidratos,

donde el aluminio se usa para revestir un primer sustrato sólido transparente a un grosor mayor de 100 nm para convertir el primer sustrato sólido transparente en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE polifluorado y donde la superficie del revestimiento de aluminio en el sustrato sólido se anodiza para formar una capa de óxido de aluminio porosa de un grosor menor de 5 nm.

2. La matriz de la reivindicación 1, donde el sustrato es conductor o semiconductor de un campo eléctrico.

3. La matriz de la reivindicación 1, donde el sustrato sólido transparente es vidrio.

4. La matriz de la reivindicación 1, donde el carbohidrato es un glucano. 25

5. La matriz de la reivindicación 1, donde los carbohidratos se inmovilizan por un enlace no covalente o por un enlace covalente.

6. La matriz de la reivindicación 5, donde los carbohidratos están polifluorados con un cola de -CnF2n+1 (n>=4) . 30

7. La matriz de la reivindicación 6, donde los carbohidratos polifluorados se aplican puntualmente en la superficie del sustrato sólido transparente revestido con aluminio de tipo PTFE.

8. La matriz de la reivindicación 5, donde los carbohidratos se modifican con un grupo funcional de ácido fosfónico,

donde los carbohidratos fosfonilados están inmovilizados en la superficie del sustrato por una interacción quelante entre el grupo de ácido fosfónico y el óxido de aluminio en la superficie del sustrato sólido transparente revestido con aluminio; o donde los carbohidratos se modifican con un conector fotosensible y un grupo funcional de silano.

9. La matriz de la reivindicación 8, donde el conector fotoescindible tiene la fórmula general: 40

en la que R1 es hidrógeno, alquilo C1-C8; R2 y R4 son cada uno de forma independiente hidrógeno, alcoxi C1-C8; R3 es alcoxi C1-C8; X es O (CO) N- (CH2) n-R5 en la que n>=3, R5 es carbohidrato, Y es el soporte sólido, como portaobjetos de ACG.

10. La matriz de la reivindicación 1, donde la caracterización espectroscópica de masas de los carbohidratos inmovilizados comprende una espectrometría de masas de tiempo de vuelo (EM-TOF) , opcionalmente seleccionada de una espectrometría de masas de deserción-ionización por láser asistida por matriz -tiempo de vuelo (MALDI-TOF) .

11. La matriz de la reivindicación 10, donde los carbohidratos son polisacáridos, u oligosacáridos, o partes de carbohidratos de un glucoconjugado, celobiosa, celotriosa, celotetraosa, GloboH o Gb5.

12. La matriz de la reivindicación 11, donde la caracterización espectroscópica de masas de los carbohidratos 55 inmovilizados comprende caracterización de los productos de carbohidratos de una reacción enzimática de celulasa.

13. La matriz de la reivindicación 12, donde la reacción enzimática de celulasa se realiza en carbohidratos inmovilizados en la superficie de la matriz, donde se sospecha que la enzima celulasa es capaz de degradar los polisacáridos inmovilizados, oligosacáridos, partes de carbohidratos de un glucoconjugado, celobiosa, celotriosa, celotetraosa, GloboH o Gb5.

14. Un método para la caracterización de carbohidratos inmovilizados en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE comprendiendo el método:

(a) proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de carbohidratos inmovilizados en localizaciones específicas en una superficie de un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE polifluorado de acuerdo con la reivindicación 1; y

(b) realizar análisis espectroscópico de masas para caracterizar los carbohidratos inmovilizados en cada

localización discreta. 15

15. El método de la reivindicación 14, donde la caracterización espectroscópica de masas de los carbohidratos inmovilizados comprende una espectrometría de masas de tiempo de vuelo (EM-TOF) .

16. El método de la reivindicación 14 que comprende además:

(c) realizar después un análisis de unión de restos que se sospecha que se unen a carbohidratos.

17. El método de la reivindicación 16, donde los restos que se sospecha que se unen a carbohidratos son proteínas

de celulasa. 25

18. El método de la reivindicación 17, que comprende además:

(d) incubar las proteínas de celulasa con los carbohidratos unidos inmovilizados en la superficie de la matriz en condiciones adecuadas para que las celulasas hidrolicen los carbohidratos.

19. El método de la reivindicación 18, que comprende además:

(e) caracterizar los productos de las proteínas de celulasa que permanecen inmovilizados en la superficie de la matriz después de hidrólisis por las celulasas, y donde las celulasas se seleccionan del grupo que consiste en 1, 4-!-glucosidasas, exoglucanasas (1, 4-!-D glucano celobiohidrolasas) y endoglucanasas (1, 4-!-D glucano glucanohidrolasas) .

20. Un método para análisis de las reacciones de unión entre los carbohidratos y moléculas que se sospecha que se unen específicamente a los carbohidratos, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una matriz que comprende una pluralidad de carbohidratos inmovilizados en localizaciones específicas en una superficie de un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE de acuerdo con la reivindicación 1;

(b) poner en contacto la matriz con una o más moléculas que se sospecha que se unen a uno o más de la 45 probabilidad de carbohidratos inmovilizados en la superficie de la matriz; y

(c) identificar la presencia o ausencia de las reacciones de unión en una o más localizaciones específicas en la superficie de la matriz.

21. El método de la reivindicación 20, donde las moléculas que se sospecha que se unen específicamente con los carbohidratos son proteínas marcadas con un marcador detectable, opcionalmente donde los marcadores proteicos comprenden colorantes fluorescentes que incluyen colorantes de cianina sensibles a amina.

22. El método de la reivindicación 20, donde la unión de una molécula con un carbohidrato en la matriz es representativa de un proceso biológico seleccionado del grupo que consiste en plegamiento proteico, secreción de

proteínas, estabilización de proteínas, infección viral, infección bacteriana, metástasis de cáncer, respuesta inflamatoria, inmunidad innata, inmunidad adaptativa, un proceso de señalización mediado por receptor y producción de biocombustibles.

23. Un método para fabricar una matriz de carbohidratos inmovilizados en un sustrato sólido no trasparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo PTFE, comprendiendo el método:

(a) proporcionar una primera superficie sólida transparente:

(b) revestir el primer sustrato sólido transparente con aluminio a un grosor de más de 100 nm para convertir el 65 primer sustrato sólido transparente en un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio;

(c) anodizar la superficie del sustrato sólido revestido con aluminio para formar una capa de óxido de aluminio porosa de grosor menor de 5 nm;

(d) opcionalmente polifluorar la superficie del sustrato sólido revestido con aluminio; y

(e) inmovilizar una pluralidad de carbohidratos en localizaciones específicas en una superficie de un sustrato

sólido no transparente revestido con aluminio o un sustrato sólido no transparente revestido con aluminio de tipo 5 PTFE mediante un enlace covalente o no covalente,

donde el sustrato es conductor o semiconductor de un campo eléctrico.

24. El método de la reivindicación 23, donde los carbohidratos están polifluorados y/o modificados con un grupo 10 funcional de ácido fosfónico.

25. Una matriz para uso en diagnóstico de enfermedad y descubrimiento de fármacos, donde la matriz se fabrica por el método de acuerdo con la reivindicación 23.