Procedimiento para la obtención de anticuerpos monoclonales a partir de muestras complejas de antígenos.

Procedimiento para la obtención de anticuerpos monoclonales a partir de muestras complejas de antígenos.

La presente invención se refiere a un proceso de selección, en un solo paso, de dominios variables de anticuerpos, preferiblemente de camello, unidos a fagos, de gran afinidad y especificidad para un antígeno concreto o diversas proteínas que comparten epítopos comunes. Además el procedimiento incluye de forma preferente una amplificación de los fagos que comprenden los dominios variables de interés, mediante la infección de bacterias por dichos fagos, lo que permite la obtención de un elevado número de copias del mismo anticuerpo, lo que permite su utilización en diferentes campos.

Procedimiento para la obtención de anticuerpos monoclonales a partir de muestras complejas de antígenos.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a un proceso de selección, en un solo paso, de dominios variables de anticuerpos unidos a fagos, preferiblemente de camello, de gran afinidad y especificidad para un antígeno concreto o diversas proteínas que comparten epítopos comunes. Dicho método incluye preferiblemente una amplificación de los fagos obtenidos mediante la infección de bacterias para obtener gran número de copias del mismo anticuerpo.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La producción de anticuerpos se ha convertido en uno de los elementos más estudiados y con mayor número de aproximaciones experimentales debido a la variedad de antígenos existentes y la necesidad de encontrar anticuerpos con alta afinidad para su reconocimiento. La mayor parte de las investigaciones se han centrado en el desarrollo de hibridomas para la producción de anticuerpos monoclonales frente a un antígeno concreto.

De forma más reciente, y de forma alternativa a la formación de hibridomas, se han empezado a utilizar las librerías de DNA para generar anticuerpos. Las librerías derivadas de genes de cadenas pesadas y ligeras permiten por recombinación, la generación de múltiples anticuerpos diferentes con diferentes afinidades lo que permite, si la biblioteca es suficientemente amplia, encontrar anticuerpos con alta afinidad frente al antígeno de interés. De cualquier forma cabe indicar que, si bien las librerías de anticuerpos que se pueden obtener cubren un amplio abanico de antígenos, el número de anticuerpos que se puede obtener contra un antígeno de interés, así como su afinidad, aumenta sensiblemente cuando se realiza la inmunización previa del animal con el antígeno purificado en presencia de un coadyuvante (Nguyen et al. 2001. Adv Immunol. 79:261296) .

Existen múltiples ejemplos en los cuales se demuestra que para obtener fragmentos capaces de unirse a un antígeno no es necesaria la producción del anticuerpo completo, sino únicamente expresar de forma recombinante regiones del anticuerpo que comprenden los dominios variables de la cadena pesada (VH) y ligera (VL) (Sundberg & Mariuzza, 2002. Adv. Protein Chem., 61:119-160) de forma que generen un fragmento monovalente (Fab) o dominios variables de cadena sencilla (scFV) que combinan fragmentos VH y VL unidos covalentemente por una secuencia polipeptídica (Harmsen & De Haard. 2007, Appl Microbiol. Biotechnol., 77:13-22) .

A partir de estas bibliotecas, se ha desarrollado la producción recombinante en bacterias de fragmentos pequeños de anticuerpos que conservan la capacidad de unir antígenos de las inmunoglobulinas completas. Esta producción bacteriana ha expandido de forma notable las aplicaciones biotecnológicas de los anticuerpos recombinantes en diversos campos que van desde el diagnóstico y la terapia a la proteómica (Cartes & Merchant, 1997. Curr. Opin. Biotechnol., 8:449-454) .

Los fragmentos pequeños de anticuerpos previamente mencionados, presentan diversas limitaciones como por ejemplo, la escasa solubilidad o la baja afinidad por el antígeno (Ward et al. 1989, Nature, 341: 544-546) . Sin embargo, el descubrimiento posterior de anticuerpos que carecen de cadenas ligeras por parte de miembros de la familia de los camélidos (Hamers-Casterman et al. 1993, Nature, 363:446-448) supuso un punto de inflexión en la producción recombinante de dominios variables (VHH o nanobodies) con capacidad de unir antígenos. Los VHH procedentes de camellos son más estables y por lo tanto más fáciles de producir, por lo que se han desarrollado diferentes estrategias para aislar anticuerpos que reconozcan específicamente un antígeno a partir de diferentes librerías (Harmsen & De Haard. 2007, Appl Microbiol. Biotechnol., 77:13-22) .

Uno de los procedimientos más comunes para el análisis de extensas librerías de anticuerpos es el conocido como phage-display. Mediante esta técnica, que relaciona el fenotipo y el genotipo de una proteína, los anticuerpos de interés son expresados como una fusión a la proteína (PIII) del fago M13 lo que permite la identificación y aislamiento de genes que codifican para VHH que reconocen específicamente un antígeno dentro de una librería (Dufner et al. 2006, Trends Biotechnol. 24:523-529) .

Esta técnica, a pesar de encontrarse ampliamente extendida, es un proceso lento y laborioso que limita considerablemente las aplicaciones biotecnológicas que se le pueden dar a las librerías de nanobodies.

Por todo ellos, sigue existiendo la necesidad de obtener anticuerpos frente a multitud de antígenos con una alta afinidad, y un método de selección sencillo rápido y fiable que acorte los procesos de producción y permita la obtención de anticuerpos mejores mediante métodos sencillos y baratos.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un método para la selección de anticuerpos de bibliotecas denominado western-panning, el cual permite una selección rápida de anticuerpos con elevada especificidad y afinidad por el antígeno de interés. Dicha selección permite seleccionar anticuerpos tanto frente a las proteínas utilizadas para la obtención del anticuerpo como frente a proteínas que no han sido utilizadas para la obtención de los anticuerpos pero que presentan epítopos comunes como por ejemplo, aunque sin limitarse enzimas que catalizan reacciones similares.

En la presente invención se demuestra como los inventores han desarrollado un método para la selección de anticuerpos unidos a fagos, y para su amplificación de forma fácil y sencilla. Además de la selección de anticuerpos frente a una proteína de interés, se demuestra que la presente invención también permite la selección de anticuerpos frente a antígenos que presentan epítopos comunes con una proteína de interés. Además, como se observa en los ejemplos, el método descrito presenta como ventaja frente a métodos de selección convencionales como el panning, una mayor especificidad de los anticuerpos seleccionados llevando a cabo un menor número de rondas de selección.

Por todo ello un primer aspecto de la invención se refiere a un método de selección de anticuerpos (de ahora en adelante método de la invención) que comprende:

a) fijar al menos una proteína de interés a una membrana,

b) poner en contacto una librería de dominios variables de anticuerpos unidos a fagos con la membrana del paso (a) ,

c) recoger la región de la membrana que contiene los dominios variables de los anticuerpos del paso (b) unidos a la proteína de (a) , y

d) eluir los dominios variables de los anticuerpos unidos a la proteína de interés.

Se entiende por anticuerpo en la presente invención a glicoproteínas de la familia de las inmunoglobulinas, caracterizadas porque tienen propiedades de unión a antígenos. Este término “anticuerpo” incluye anticuerpos tanto monoclonales como policlonales que pertenecen a cualquier clase de anticuerpos, por ejemplo, IgG, IgD, IgM, IgA, IgE o derivados de los mismos. El término anticuerpo no pretende limitarse a una fuente particular del anticuerpo o a la forma en que se produce. El anticuerpo puede ser obtenido de un ser humano o animal o mediante técnicas de DNA recombinante o síntesis química de genes.

Se entiende por “dominios variables” a las regiones dentro de los anticuerpos que participan en el reconocimiento especifico del antígeno. Son conocidas como variables puesto que su naturaleza y secuencia varían en cada anticuerpo en función de su especificidad mientras que el resto de la proteína conserva una estructura constante.

Se entiende por “fago” en la presente invención aquellos virus que presentan capacidad infectiva y que aprovechan la maquinaria de la célula infectada para llevar a cabo su propia replicación.

La proteína del paso (a) se puede encontrar tanto en forma nativa como desnaturalizada, en función de lo que se requiera en cada caso, ya que algunos anticuerpos solo reconocen regiones de la proteína en conformaciones específicas mientras que otros reconocen regiones expuestas tanto en forma nativa como desnaturalizada. La proteína desnaturalizada presenta más regiones expuestas que pueden permitir la selección de un mayor número de anticuerpos frente a diversos epítopos. Por todo ello, en una realización preferida del método de la invención la proteína se encuentra desnaturalizada.

Se entiende por “conformación nativa” en la presente invención, aquella conformación tridimensional de la proteína cuando se... [Seguir leyendo]

1. Método de selección de anticuerpos que comprende: a) fijar al menos una proteína de interés a una membrana, b) poner en contacto una librería de dominios variables de anticuerpos unidos a fagos con la membrana del paso (a) , c) recoger la región de la membrana que contiene los dominios variables de los anticuerpos del paso (b) unidos a la proteína de (a) , y d) eluir los dominios variables de los anticuerpos unidos a la proteína de interés.

2. Método según la reivindicación 1 donde la proteína se encuentra desnaturalizada.

3. Método cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la proteína de interés del paso (a) se selecciona de la lista que comprende: NicX, NBDO, BPDO, BphC, Benzilsuccinato sintasa, Benzoil-CoA reductasa, Lacasa, nalkano monooxigenasa p-450, LinB, ArsC o OaGST.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la fijación de la proteína del paso (a) se lleva a cabo mediante electrotransferencia.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la fijación de una proteína a la membrana está precedida por una electroforesis.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde los fagos a los que se encuentran unidos los dominios variables se seleccionan de entre fagos M13, fd, T4, T7 y lambda.

7. Método según la reivindicación 6 donde los fagos son fagos M13.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde los dominios variables del paso (b) provienen de anticuerpos procedentes de un individuo de la familia camelidae.

9. Método según la reivindicación 8 donde el individuo de la familia camelidae es Camellus dromedarius.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la elución del paso (d) se lleva a cabo mediante la adición de glicina.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que además comprende un paso (e) donde los dominios variables de los anticuerpos unidos a fagos eluidos en (d) se amplifican mediante la infección de bacterias.

12.Método según la reivindicación 11 donde las bacterias infectadas en el paso (e) son E. coli.

FIG. 1

FIG. 2

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FIG. 3

FIG. 4

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OFICINA ESPANOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPANA

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. Ver Hoja Adicional

N.O solicitud: 201131152 22 Fecha de presentación de la solicitud: 06.07.2011 32 Fecha de prioridad:

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoria @ Documentos citados Reivindicaciones afectadas

x x A A ZAFRA, O . et al . " Monitoring bi odegradative enz ymes with nanobodies raised i n C amelus dromedarius with mixtures o f ca tabolic p roteins". EN VIRONMENTAL MI CROBIOLOGY. 01.04.2011. Vol. 13, N". 4, pagina.

96. 974; todo el documento. SAERENS, D. et al. "Parallel selection of multiple anti-infectome Nanobodies without access to purified antigens". JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS. 01.01.2008. Vol. 329, N". 1-2, pagina.

13. 150; todo el documento, especialmente apartados 2.7 y 3.3. DUFNER, P. et al. "Harnessing phage and ribosome display for antibody optimisation". TRENDS IN BIOTECHNOLOGY. Vol. 24, N". 11, pagina.

52. 529; todo el documento. HARMSEN, M .M. et al . " Properties, pr oduction, and applications of ca melid si ngle-domain antibody fragments". APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL. 18.08.2007. Vol. 77, N". 1, paginas 13-22; todo el documento. 1-12 1, 6-9, 11, 12 1-12 1-12

Categoria de los documentos citados x: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoria A: refleja el estado de la tecnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despues de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado º para todas las reivindicaciones º para las reivindicaciones nO:

Fecha de realización del informe 22.10.2012 Examinador M. Novoa Sanjurjo Pagina 1/4

INFORME DEL ESTADO DE LA TECNICA

NO de solicitud: 201131152

CLASIFICACION OBJETO DE LA SOLICITUD C07K16100 (2006.01)

C12N15110 (2006.01) C12P21108 (2006.01) Documentación minima buscada (sistema de clasificación seguido de los simbolos de clasificación)

C07K, C12N, C12P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la busqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, terminos de busqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, BIOSIS, GOOGLE

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 2/4

OPINION ESCRITA

NO de solicitud: 201131152

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 22.10.2012

Declaración

Novedad (Art. .1 LP 11/198 ) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-12 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/198 ) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-12 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tecnico de la solicitud (Articulo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opinión.

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

Consideraciones La invención consiste en un proceso de selección de anticuerpos de camello obtenidos a partir de muestras complejas de antigenos. Los ant icuerpos estan uni dos a f agos y p ueden obt enerse gr andes cantidades de l os mismos mediante l a infección de bacterias. Los anticuerpos tienen afinidad por proteinas con las que comparten epitopos, que en el proceso de selección estan fijadas a membranas.

Informe del Estado de la Tecnica Pagina 3/4

OPINION ESCRITA

NO de solicitud: 201131152

1. Documentos considerados.

A co ntinuación se r elacionan l os doc umentos pertenecientes al est ado de la t ecnica t omados en c onsideración para l a realización de esta opinión.

Documento Numero Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01 ZAFRA, O . e t al . " Monitoring b iodegradative e nzymes with nanobodies raised in C amelus dromedarius with mixtures of catabolic proteins". ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY. 01.04.2011. Vol. 13, N". 4, pagina.

96. 974; todo el documento.

D02 SAERENS, D. et al. " Parallel se lection of m ultiple anti-infectome Nanobodies without acc ess to pur ified antigens". JO URNAL O F IMMUNOLOGICAL MET HODS. 01.01.2008. Vol. 32 9, N ". 1 -2, pagina.

13. 150; t odo el d ocumento, especialmente a partados 2.7 y 3.3.

D03 DUFNER, P . e t al . " Harnessing phage an d r ibosome display f or antibody optimisation". TRENDS IN BIOTECHNOLOGY. Vol. 24, N". 11, pagina.

52. 529; todo el documento.

D04 HARMSEN, M. M. e t a l. " Properties, p roduction, a nd applications of ca melid si ngle-domain antibody fragments". APPL. MICROBIOL. BIOTECHNOL. 18.08.2007. Vol. 77, N". 1, paginas 13-22; todo el documento.

El doc umento D 01, es la p ublicación c ientifica del proceso d e l a i nvención. L a p ublicación es anterior a l a f echa d e presentación de la solicitud de patente. El documento D02, describe la obtención de una biblioteca de nanoanticuerpos al infectar un dromedario con el parasito Tr y panosoma evansi. Los nanoanticuerpos obtenidos se se leccionan e n un pr ocedimiento m uy s imilar al de l a pr esente solicitud. El doc umento D 03, pr esenta un a r evisión so bre la obtención d e ant icuerpos utilizando f agos que los expresan en s u superficie (tecnologia de "phage display") . El documento D04-El documento D04, revisa las caracteristicas y utilidades de los anticuerpos (nanoanticuerpos) obtenidos de camelidos, que se caracterizan por tener un unico dominio y ser mucho mas pequefos que los anticuerpos humanos.

2. Declaración motivada segun los articulos 29. y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/198 , de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración NOVEDAD Y ACTIVIDAD INVENTIVA Reivindicaciones 1-12 El procedimiento de selección de anticuerpos reivindicado en la presente solicitud, ha sido descrito previamente en el estado de la tecnica en el documento D01. Las reivindicaciones 1-12, no cumplen los requisitos de novedad y actividad inventiva de acuerdo a los Articulos 6 y 8 de la Ley de Patentes 11/1986.

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