Procedimiento para la evaluación in vitro del estado de progresión de una infección por un virus del VIH en un individuo.

Procedimiento para la evaluación in vitro del estado de progresión de la infección de un individuo con un virus del VIH,

en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a) incubar una muestra biológica con un compuesto ligando seleccionado de entre el grupo que consiste en (i) un anticuerpo dirigido a la proteína NKp44L de SEC ID Nº 1, o sobre la parte del dominio extracelular de la misma, y (ii) la proteína NKp44 de SEC ID Nº 2, o un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma; y

(b) medir la cantidad de dicho compuesto ligando que está unido a las células T CD4+, siendo dicha cantidad medida de dicho compuesto ligando unido indicativa del estado de progresión de la infección viral.

Procedimiento para la evaluación in vitro del estado de progresión de una infección por un virus del VIH en un individuo.

Campo de la invención La presente invención se refiere al campo del diagnóstico in vitro del estado de progresión de una infección de un individuo con un virus que pertenece a la familia de los virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) , así como con el tratamiento terapéutico de esta enfermedad infecciosa.

Antecedentes de la invención La enfermedad del SIDA, que está provocada principalmente por la infección de individuos con un retrovirus del VIH, es actualmente la enfermedad más devastadora en todo el mundo, puesto que el número de individuos que están infectados hasta la fecha con los virus del VIH se estima en alrededor de 40 millones de individuos.

Durante sólo el año 2001, 5 millones de individuos se infectaron con el VIH, mientras que 3 millones de individuos han muerto al mismo tiempo. Desde el descubrimiento del agente etiológico principal del SIDA en 1983, a saber, el virus del VIH, se han realizado amplios esfuerzos a fin de comprender el mecanismo de acción de este virus y desarrollar procedimientos exactos para (i) diagnosticar de forma reproducible la infección, así como (ii) llevar a cabo un pronóstico de la progresión de la enfermedad en un paciente dado.

Con fines de vigilancia, los United States Centers for Disease Control (CDC) definen actualmente al SIDA en un adulto o adolescente de 13 años de edad o mayor como la presencia de una de las 25 condiciones indicadoras de SIDA, tales como KS, PCP o MAC diseminado. En niños menores de 13 años, la definición de SIDA es similar a aquella en adolescentes y adultos, excepto que se incluyen en la lista de afecciones que definen al SIDA (CDC, 1987b) a la neumonitis intersticial linfoide y a infecciones bacterianas recurrentes. La definición de caso en adultos y adolescentes se amplió en 1993 para incluir la infección por VIH en un individuo con un recuento de células T CD4+ menor que 200 células por milímetro cúbico (mm3) de sangre (CDC, 1992) . La definición de vigilancia sustituyó a los criterios publicados en 1987 que se basaban en estados clínicos y signos de infección por VIH pero no en determinaciones de células T CD4+ (CDC, 1987) .

En la práctica clínica, la sintomatología y las medidas de la infección inmunitaria, principalmente niveles de linfocitos T CD4+, se usan para guiar el tratamiento de personas infectadas por el VIH.

El VIH infecta y mata a linfocitos T CD4+ in vitro, aunque los científicos han desarrollado líneas de células T inmortalizadas a fin de propagar el VIH en el laboratorio (Popovic et al., 1984; Zagur y et al., 1986; Garr y , 1989; Clark et al., 1991) . Se han observado varios mecanismos de exterminio de células T CD4+ en sistemas lentivíricos in vitro, y pueden explicar la pérdida progresiva de estas células en individuos infectados por VIH (revisado en Garr y , 1989; Fauci, 1993a; Pantaleo et al., 1993a) . Estos mecanismos incluyen la destrucción de la membrana celular como yemas de VIH de la superficie (Leonard et al., 1988) o la acumulación intracelular de ARN heterodispersos y ADN no integrado (Pauza et al., 1990; Koga et al., 1988) . Las pruebas también sugieren que la formación de complejos intracelulares de CD4 y productos de la cubierta vírica puede dar como resultado el extermino celular (Hoxie et al., 1986) .

Además de estos mecanismos directos del agotamiento de células T CD4+, los mecanismos indirectos pueden dar como resultado la muerte de células T CD4+ no infectadas (revisado en Fauci, 1993a; Pantaleo et al., 1993a) . Las células no infectadas se fusionan a menudo con células infectadas, dando como resultado células gigantes denominadas sincitios, que se han asociado con el efecto citopático de VIH in vitro (Sodroski et al., 1986; Lifson et al., 1986) . Las células no infectadas también pueden ser exterminadas cuando gp120 libre, la proteína de cubierta del VIH, se une a sus superficies, marcándolas para la destrucción por respuestas de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (Lyerly et al., 1987) . Otros fenómenos autoinmunitarios también pueden contribuir a la muerte de células T CD4+, ya que las proteínas de cubierta del VIH comparten cierto grado de homología con ciertas moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad tipo II (MHC-II) (Golding et al., 1989; Koenig et al., 1988) .

Un número de investigadores ha sugerido que los superantígenos, ya sea que estén codificados por VIH o que deriven de agentes no relacionados, pueden disparar la estimulación masiva y expansión de células T CD4+, conduciendo finalmente al agotamiento o anergia de estas células (Janeway, 1991; Hugin et al., 1991) . La inducción inoportuna de una forma de muerte celular programada denominada apoptosis se ha propuesto como un mecanismo adicional para la pérdida de células T CD4+ en infección por VIH (Ameisen y Capron, 1991; Terai et al., 1991; Laurent-Crawford et al., 1991) . Informes recientes indican que la apoptosis se produce en mayor extensión en individuos infectados por VIH que en personas no infectadas, tanto en la sangre periférica como en los ganglios linfáticos (Finkel et al., 1995; Pantaleo y Fauci, 1995b; Muro-Cacho et al., 1995) .

La Solicitud PCT nº WO 02/08287 describe receptores activadores de células NK y sus usos terapéuticos y de diagnóstico. Este documento describe composiciones y procedimientos para el tratamiento y detección de una variedad de infecciones víricas, usando agentes complejos que comprenden las proteínas activadoras de células NK, NKp46 y NKp44, y sus fragmentos funcionales, enlazados a agentes terapéuticos o de formación de imágenes. Se afirma que el complejo descrito en el documento WO 02/08237 es dirigido hacia una célula defectuosa o enferma, como células infectadas por virus, incluyendo células infectadas con el virus de la inmunodeficiencia humana.

Chen et al. (2000, Aids Research and Human Retroviruses, Vol. 16 (18) : 2037-2041) describen diversos péptidos derivados de la gp41 del VIH-1 y localizados en un región que comprende las regiones HR1 y HR2 de gp41, así como anticuerpos dirigidos a ellos. Según Chen et al. (2000) , estos anticuerpos que son capaces de interactuar con el núcleo de la gp41 putativa activa en la fusión pueden ser útiles desvelando adicionalmente el mecanismo de la fusión de membrana inducida por VIH.

También se ha observado que VIH infecta precursores de células T CD4+ en la médula ósea y en el timo, y daña el microentorno de estos órganos necesario para el sostenimiento y la maduración óptimos de células progenitoras (Schnittman et al., 1990b; Stanley et al., 1992) . Estos hallazgos pueden ayudar a explicar la falta de regeneración del conjunto de células T CD4+ en pacientes con SIDA (Fauci, 1993a) .

Estudios recientes han demostrado una carga viral sustancial y una replicación viral activa tanto en la sangre periférica como en tejidos linfoides incluso tempranamente en infección por VIH (Fox et al., 1989; Coombs et al., 1989; Ho et al., 1989; Michael et al., 1992; Bagnarelli et al., 1992; Pantaleo et al., 1993b; Embretson et al., 1993; Piatak et al., 1993) . Un grupo ha informado de que el 25 por ciento de células T CD4+ en los ganglios linfáticos de individuos infectados por VIH poseen ADN del VIH tempranamente en el transcurso de la enfermedad (Embretson et al., 1993) . Otros datos sugieren que la infección por VIH es sostenida por un proceso dinámico que implica rondas continuas de nueva infección vírica y la destrucción y sustitución de alrededor de 1 millardo de células T CD4+ por día (Wei et al., 1995; Ho et al., 1995) .

Con respecto al pronóstico de la progresión de la enfermedad en pacientes con VIH, un primer procedimiento actual consiste en evaluar el incremento en el número de virus del VIH que están presentes en una sangre completa.

También se ha observado que el VIH infecta a precursores de células T CD4+ en la médula ósea y el timo, y daña al microentorno de estos órganos necesario para el sostenimiento y maduración óptimos de células progenitoras (Schnittman et al., 1990b; Stanley et al., 1992) . Estos hallazgos pueden ayudar a explicar la falta de regeneración del conjunto de células T CD4+ en pacientes con SIDA (Faucl 1993a) .

Estudios recientes han demostrado una carga viral sustancial y una replicación viral activa tanto en la sangre periférica como en tejidos linfoides incluso tempranamente en infección por VIH (Fox et al., 1989; Coombs et al., 1989; Ho et al., 1989; Michael et al., 1992; Bagnarelli et al., 1992; Pantaleo et al., 1993b; Embretson et al., 1993; Piatak et al., 1993) . Un grupo ha informado de que el 25 por ciento de células T... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la evaluación in vitro del estado de progresión de la infección de un individuo con un virus del VIH, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a) incubar una muestra biológica con un compuesto ligando seleccionado de entre el grupo que consiste en (i) un anticuerpo dirigido a la proteína NKp44L de SEC ID Nº 1, o sobre la parte del dominio extracelular de la misma, y (ii) la proteína NKp44 de SEC ID Nº 2, o un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma; y

(b) medir la cantidad de dicho compuesto ligando que está unido a las células T CD4+, siendo dicha cantidad medida de dicho compuesto ligando unido indicativa del estado de progresión de la infección viral.

2. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica contiene células sanguíneas recogidas de un paciente infectado con un virus del VIH, y en el que dicha cantidad medida de dicho compuesto ligando unido es indicativa de la tasa de células T CD4+ contenidas en dicha muestra biológica.

3. Procedimiento in vitro según la reivindicación 1, en el que dicha muestra biológica contiene células sanguíneas recogidas de un paciente infectado con un virus del VIH, y dicha cantidad medida de dicho compuesto ligando unido es indicativa de la carga viral del VIH de dicha muestra biológica.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha muestra biológica se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) una muestra de sangre completa, (ii) una suspensión de células mononucleares y polimorfonucleares periféricas purificada a partir de una muestra de sangre completa, (iii) una suspensión de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) purificada a partir de una muestra de sangre completa, (iv) una suspensión de células T purificada a partir de una muestra de sangre completa, y (v) una suspensión de células T CD4+ purificada a partir de una muestra de sangre completa.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho compuesto ligando está marcado con una molécula detectable.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicha molécula detectable se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) una molécula radioactiva, (ii) una molécula fluorescente, (iii) una molécula luminiscente, y (iv) una molécula receptora que es reconocida selectivamente por una molécula ligando.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha molécula radioactiva está marcada con un isótopo radioactivo seleccionado de entre el grupo que consiste en [32P], [3H] y [35S].

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha molécula fluorescente se selecciona de entre el grupo que consiste en una proteína fluorescente verde o una proteína fluorescente amarilla.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha molécula luminiscente consiste en la luciferasa.

10. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicha molécula receptora consiste en una molécula que contiene avidina o una estreptavidina.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa (b) de medición de la cantidad de dicho compuesto ligando que está unido a las células T CD4+ consiste en un análisis citofluorométrico de dicha muestra biológica que se ha incubado con dicho compuesto ligando en la etapa (a) de dicho procedimiento.

12.Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la etapa (b) de medición de la cantidad de dicho compuesto ligando que está unido a las células T CD4+ consiste en numerar mediante microscopía, incluyendo la microscopía confocal, las células contenidas en dicha muestra biológica sobre las que está unido dicho compuesto ligando.

13. Kit para la evaluación in vitro del estado de progresión de la infección de un individuo con un virus del VIH, en el que dicho kit comprende:

(i) un compuesto ligando seleccionado de entre el grupo que consiste en (i) un anticuerpo dirigido a la proteína NKp44L de SEC ID Nº 1, o a la parte del dominio extracelular de la misma, y (ii) la proteína NKp44 de SEC ID Nº2, o un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma; y

(ii) una molécula marcadora que se une específicamente al antígeno CD4.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que tanto (i) el compuesto ligando como (ii) la molécula marcadora se marcan fluorescentemente de manera diferencial.

15. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, en el que el compuesto ligando consiste en un anticuerpo monoclonal marcado que se une específicamente a la proteína NKp44L de SEC ID Nº1, o a la parte del dominio extracelular de la misma.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la molécula marcadora marcada consiste en un anticuerpo monoclonal anti-CD4.

17. Procedimiento para el cribado in vitro de compuestos para tratar un individuo infectado con un virus del VIH, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a) incubar un compuesto candidato que se va a someter a prueba con un sistema de cribado en un disolvente líquido, en el que dicho sistema de cribado comprende:

(i) una primera pareja que expone al disolvente una pluralidad de moléculas de la proteína NKp44L de SEC ID Nº1, o una pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma; y

(ii) una segunda pareja que expone al disolvente una pluralidad de moléculas de la proteína receptora NKp44 de SEC ID Nº2, o una pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma;

en el que (iii) la pluralidad de moléculas de la proteína NKp44L de SEC ID Nº1, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma, por un lado, y

(iv) la pluralidad de moléculas de la proteína receptora NKp44 de SEC ID Nº2, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma, por otro lado, pueden unirse entre sí;

(b) cuantificar la unión de (iii) la pluralidad de moléculas de la proteína NKp44L de SEC ID Nº1, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma a (iv) la pluralidad de moléculas de la proteína receptora NKp44 de SEC ID Nº2, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma;

(c) comparar la unión que se cuantifica en la etapa (b) con la unión que se cuantifica cuando se lleva a cabo la etapa (a) en ausencia de dicho compuesto candidato;

(d) seleccionar de manera positiva el compuesto candidato como agente terapéutico cuando dicho compuesto candidato inhibe o bloquea la unión de (iii) la pluralidad de moléculas de la proteína NKp44L de SEC ID Nº1,

o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma a

(iv) la pluralidad de moléculas de la proteína receptora NKp44 de SEC ID Nº2, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma.

18. Kit para el cribado in vitro de compuestos para tratar un individuo infectado con un virus del VIH, en el que dicho kit comprende un sistema de cribado que comprende:

(i) una primera pareja que expone al disolvente una pluralidad de moléculas de la proteína NKp44L de SEC ID Nº1, o una pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma;

(ii) una segunda pareja que expone al disolvente una pluralidad de moléculas de la proteína receptora NKp44 de SEC ID Nº2, o una pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma; en el que

(iii) la pluralidad de moléculas de la proteína NKp44L de SEC ID Nº1, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma, por un lado, y (iv) la pluralidad de moléculas de la proteína receptora NKp44 de SEC ID Nº2, o la pluralidad de moléculas de un polipéptido que comprende la parte del dominio extracelular de la misma, por otro lado, pueden unirse entre sí.

19. Procedimiento para el cribado in vitro de compuestos para tratar un individuo infectado con un virus del VIH, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una primera población de células que consiste en células NK activadas humanas y una segunda población de células que consiste en células T CD4+ que expresan la proteína NKp44L, en presencia de un compuesto terapéutico candidato que se va a someter a prueba;

(b) medir la citólisis de las células T CD4+ por las células NK activadas;

(c) comparar el valor de citólisis obtenido en la etapa (b) con el valor de citólisis obtenido cuando la etapa (a) se lleva a cabo en ausencia del compuesto candidato; seleccionar los compuestos candidatos que inhiben o bloquean la citólisis de las células T CD4+ mediada por NK.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que las células NK activadas pueden consistir en células de una estirpe de células NK, o pueden consistir en un cultivo primario de células NK purificadas humanas normales.

21. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que las células T CD4+ que expresan las proteína NKp44L consisten en células T CD4+, eventualmente en forma de una estirpe celular, que se han transfectado con un vector que permite la expresión por dichas células de la proteína NKp44L, o consisten en células T CD4+ que se purificaron inicialmente de una muestra de sangre de un paciente infectado con el VIH.

22. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que las células NK activadas y las células T CD4+ son autólogas y proceden ambas del mismo paciente infectado con el VIH.

23. Composición farmacéutica para tratar un individuo infectado con un virus de la familia del VIH, que comprende una cantidad eficaz de un compuesto que se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) un anticuerpo dirigido a la proteína NKp44L de SEC ID Nº 1, o a la parte del dominio extracelular de la misma, y (ii) un polinucleótido antisentido que se hibrida específicamente con las moléculas de ARNm que codifican la proteína NKp44L de SEC ID N° 1, en combinación con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.

24. Composición farmacéutica según la reivindicación 23, en la que dicho polinucleótido antisentido consiste en el ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico que parte en el nucleótido nº 1 y que termina en el nucleótido nº 902 de la secuencia nucleotídica SEC ID Nº 3.

25. Utilización de un compuesto que se selecciona de entre el grupo que consiste en (i) un anticuerpo dirigido a la proteína NKp44L de SEC ID Nº 1, o a la parte del dominio extracelular de la misma, y (ii) un polinucleótido antisentido que se hibrida específicamente con las moléculas de ARNm que codifican la proteína NKp44L de SEC ID Nº 1, para preparar una composición farmacéutica para tratar un individuo infectado con un virus de la familia del VIH.

26. Utilización según la reivindicación 25, en la que dicho polinucleótido antisentido consiste en el ácido nucleico que es complementario al ácido nucleico que parte en el nucleótido nº1 y que termina en el nucleótido nº902 de la secuencia nucleotídica SEC ID Nº3.

27. Polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos siguiente:

PWASNASWSNKSLDDIW

28. Procedimiento para el cribado in vitro de compuestos para tratar la infección de un individuo con un virus del VIH, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(i) incubar un compuesto candidato que se va a someter a prueba con un polipéptido según la reivindicación 27,

(ii) someter a ensayo la unión del compuesto candidato que se va a someter a prueba con un polipéptido según la reivindicación 27.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, en el que la etapa (ii) consiste en someter a un ensayo de migración en gel a la mezcla obtenida al final de la etapa (i) , y detectar los complejos formados entre el compuesto candidato y un polipéptido según la reivindicación 27.

30. Procedimiento para el cribado in vitro de compuestos para tratar un individuo infectado con un virus del VIH, en el que dicho procedimiento comprende las etapas de:

a)

(i) poner en contacto un primer cultivo de células T CD4+ con un compuesto candidato, y virus del VIH;

(ii) poner en contacto un segundo cultivo de células T CD4+ con el virus del VIH, en ausencia de dicho compuesto candidato; y

b) detectar la presencia de NKp44L en la superficie de las células T CD4+ proveniente del cultivo (i) y (ii) .

31. Procedimiento según la reivindicación 30, que comprende una etapa adicional (c) que consiste en seleccionar positivamente el compuesto candidato como un agente terapéutico cuando el nivel de expresión de NKp44L en la superficie de las células T CD4+ proveniente del cultivo (ii) es mayor que el nivel de expresión de NKp44L en la superficie de las células T CD4+ proveniente del cultivo (i) .

32. Procedimiento para el cribado in vitro de compuestos para tratar un individuo infectado con un virus del VIH, en el 5 que dicho procedimiento comprende las etapas de:

(i) someter un compuesto candidato a un procedimiento de cribado según cualquiera de las reivindicaciones 28 y 29, y

(ii) someter un compuesto candidato seleccionado positivamente en la etapa (i) al procedimiento de cribado según cualquiera de las reivindicaciones 30 y 31.

33. Composición farmacéutica para tratar un individuo infectado con un virus de la familia del VIH, que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo dirigido al polipéptido según la reivindicación 27. 15

34. Utilización de un anticuerpo dirigido al polipéptido según la reivindicación 27, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar la infección de un individuo con un virus de la familia del VIH.

35. Composición farmacéutica para tratar un individuo infectado con un virus de la familia del VIH, que comprende

una cantidad eficaz de un polipéptido según la reivindicación 27, en combinación con al menos un excipiente fisiológicamente aceptable.