Heterodímero de integrina y subunidad del mismo.
Subunidad α10 de integrina de unión a colágeno aislada o recombinante quecomprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No.
1, o una variante decorte y empalme de la misma, o un fragmento de la mismaen la que:
la variante de corte y empalme comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No.2; y el fragmento se selecciona del grupo que consiste en fragmentos que comprendenla secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, fragmentos que comprendenla secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácidon.º 986 de SEQ ID No. 1 y fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidosdesde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/SE1999/000544.
Solicitante: XINTELA AB.
Nacionalidad solicitante: Suecia.
Dirección: C/O EVY LUNDGREN AKERLUND TROLLSJOVAGEN 165 237 33 BJARRED SUECIA.
Inventor/es: LUNDGREN-AKERLUND,EVY.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- A61K38/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
- A61P19/00 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES. › Medicamentos para el tratamiento de problemas del esqueleto.
- A61P9/00 A61P […] › Medicamentos para el tratamiento de trastornos en el aparato cardiovascular.
- C07K14/705 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.
- C07K16/28 C07K […] › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra receptores, antígenos celulares de superficie o determinantes celulares de superficie.
- C12N1/15 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N1/19 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
- C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
- C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
- C12P21/02 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 21/00 Preparación de péptidos o de proteínas (proteína monocelular C12N 1/00). › que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation.
- C12P21/08 C12P 21/00 […] › Anticuerpos monoclonales.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
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Fragmento de la descripción:
Heterodímero de integrina y subunidad del mismo Campo de la invención La presente invención se refiere a un heterodímero de integrina aislado o recombinante que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, a la subunidad a10 del mismo, a homólogos y fragmentos de dicha integrina y de dicha subunidad a10 que tienen actividad biológica similar, a procedimientos de producción del mismo, a polinucleótidos y oligonucleótidos que codifican para el mismo, a vectores y células que comprenden el mismo, a entidades de unión que se unen específicamente al mismo, y al uso del mismo.
Antecedentes de la invención Las integrinas son una gran familia de glicoproteínas transmembrana que median en interacciones célula-célula y célula-matriz (1-5) . Todos los miembros conocidos de esta superfamilia son heterodímeros asociados no covalentemente compuestos por una subunidad ay una p. En la actualidad, se han caracterizado 8 subunidades p (p1-p8)
(6) y 16 subunidades a (a1-a9, av, aM, aL, aX, aIIb, aE y aD) (6-21) , y estas subunidades se asocian para generar más de 20 integrinas diferentes. Se ha mostrado que la subunidad p1 se asocia con diez subunidades adiferentes, a1-a9 y av, y que media en interacciones con proteínas de la matriz extracelular tales como colágenos, lamininas y fibronectina. Las integrinas de unión a colágeno principales son a1p1 y a2p1 (22-25) . Se ha notificado también que las integrinas a3p1 y a9p1 interaccionan con colágeno (26, 27) aunque esta interacción no se entiende bien (28) . Las regiones N-terminales extracelulares de las subunidades de integrina ay pson importantes en la unión de ligandos (29, 30) . La región N-terminal de las subunidades a está compuesta por una secuencia repetida siete veces (12, 31) que contiene secuencias consenso FG y GAP. Se pronostica que las repeticiones se pliegan en un dominio de hélice p (32) conteniendo las últimas tres o cuatro repeticiones supuestos sitios de unión de cationes divalentes. Las subunidades de integrina aa1, a2, aD, aE, aL, aM y aX contienen un dominio insertado de º200 aminoácidos, el dominio I (dominio A) , que muestra similitud con secuencias en el factor de von Willebrand, la proteína de la matriz de cartílago y los factores del complemento C2 y B (33, 34) . El dominio I se localiza entre las repeticiones de FG-GAP segunda y tercera, contiene un sitio de adhesión dependiente de ión metálico (MIDAS) y está implicado en la unión de ligandos (35-38) .
Los condrocitos, el único tipo de células en el cartílago, expresan varias integrinas diferentes incluyendo a1p1, a2p1, a3p1, a5p1, a6p1, avp3 y avp5 (39-41) . Se ha mostrado que a1p1 y a2p1 median en interacciones de condrocitos con colágeno tipo II (25) que es uno de los componentes principales en el cartílago. Se ha mostrado también que a2p1 es un receptor para la proteína de la matriz de cartílago condroadherina (42) .
Holmvall et al (Exp. Cell Res. Vol. 221, 1995, págs. 496-503) describen la investigación de integrinas de condrocitos con afinidad por colágeno tipo II así como cambios en la expresión de ARNm que codifican para colágeno tipo II, agrecano y diversas subunidades de integrina en respuesta a estrés mecánico dinámico. Además, Camper et al. encontraron una integrina p1 de unión a colágeno tipo II con una subunidad aligeramente mayor que a2. Esta subunidad de integrina estaba presente tanto en condrocitos bovinos como células de condrosarcoma humanas pero no pudieron identificarla con ningún anticuerpo frente a a1, a2, a3, o a9. Este estudio no se realizó en condrocitos humanos.
Camper et al. (J. Biol. Chem., vol. 273, 1998, págs. 1159-1167) es un artículo publicado posteriormente que describe el aislamiento, la clonación y el análisis de secuencia de la subunidad a10 de integrina, una integrina de unión a colágeno asociada a p1 expresada en condrocitos.
Sumario de la invención La presente invención se refiere a una integrina de unión a colágeno tipo II novedosa, que comprende una subunidad a10 en asociación con una subunidad p, especialmente una subunidad p1, pero también pueden contemplarse otras subunidades p. En realizaciones preferidas, esta integrina se ha aislado de condrocitos articulares bovinos o humanos, y células de condrosarcoma humanas.
La presente invención se refiere en particular a una subunidad a10 de integrina aislada o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, y homólogos y o fragmentos de la misma según la reivindicación 1.
La invención se refiere además a un procedimiento de producción de una subunidad a10 de integrina recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o fragmentos de la misma, procedimiento que comprende las etapas de a) aislar un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma,
b) construir un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado,
c) transformar una célula huésped con dicho vector de expresión,
d) cultivar dicha célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de la subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma, en dicha célula huésped transformada, y, opcionalmente,
e) aislar la subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma, a partir de dicha célula huésped transformada o dicho medio de cultivo.
La subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma, puede proporcionarse también mediante aislamiento a partir de una célula en la que está presente de manera natural.
La invención también se refiere a un polinucleótido aislado que comprende un nucleótido que codifica para subunidad a10 de integrina, o fragmentos de la misma según la reivindicación 1, polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o partes de la misma.
La invención se refiere en un aspecto adicional a vectores que comprenden los polinucleótidos anteriores, y a células que contienen dichos vectores y células que tienen polinucleótidos u oligonucleótidos mostrados en SEQ ID No. 1 ó 2 integrados en su genoma.
La invención también se refiere a entidades de unión que tienen la capacidad de unirse específicamente a la subunidad a10 de integrina o fragmentos de la misma, tales como proteínas, péptidos, hidratos de carbono, lípidos, ligandos naturales, anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales.
En un aspecto adicional, la invención se refiere a un heterodímero de integrina aislado o recombinante que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, en el que la subunidad a10 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, o fragmentos de la misma.
En una realización preferida de la misma, la subunidad p es p1.
La invención también se refiere a un procedimiento de producción de un heterodímero de integrina recombinante que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, en el que la subunidad a10 comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1 o SEQ ID No. 2, procedimiento que comprende las etapas de a) aislar un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una subunidad a10 de un heterodímero de integrina y, opcionalmente, otro polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una subunidad p de un heterodímero de integrina, o fragmentos de la misma,
b) construir un vector de expresión que comprende dicho polinucleótido aislado que codifica para dicha subunidad a10 en combinación con un vector de expresión que comprende dicho nucleótido aislado que codifica para dicha subunidad p,
c) transformar una célula huésped con dichos vectores de expresión,
d) cultivar dicha célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de un heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo, en dicha célula huésped transformada, y, opcionalmente,
e) aislar el heterodímero de integrina que comprende una subunidad a10 y una subunidad p, o fragmentos del mismo, a partir de dicha célula huésped transformada o dicho medio de cultivo.
El heterodímero de integrina, o fragmentos del mismo, también puede proporcionarse mediante aislamiento a partir de una célula en la que está presente de manera natural.
La invención se refiere además a una célula que contiene un primer vector, comprendiendo dicho primer vector un polinucleótido que codifica para una subunidad a10 de un heterodímero de integrina, o partes de la misma, polinucleótido que comprende... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Subunidad a10 de integrina de unión a colágeno aislada o recombinante que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1, o una variante de corte y empalme de la misma, o un fragmento de la misma en la que:
la variante de corte y empalme comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID No. 2; y el fragmento se selecciona del grupo que consiste en fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1 y fragmentos que comprenden la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1.
2. Subunidad a10 de integrina, según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 1.
3. Variante de corte y empalme según la reivindicación 1.
4. Variante de corte y empalme según la reivindicación 3, consistiendo la variante de corte y empalme en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID No. 2.
5. Fragmento según la reivindicación 1.
6. Fragmento según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ.
7. Fragmento según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácido n.º 986 de SEQ ID No. 1.
8. Fragmento según la reivindicación 5, comprendiendo el fragmento la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID No. 1.
9. Polinucleótido aislado que codifica para una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Polinucleótido aislado según la reivindicación 9, que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID No. 1 ó 2.
11. Vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10.
12. Célula que comprende un vector según la reivindicación 11.
13. Procedimiento para producir una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, procedimiento que comprende las etapas de:
(a) aislar un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10;
(b) construir un vector de expresión que comprende el polinucleótido aislado;
(c) transformar una célula huésped con dicho vector de expresión; y
(d) cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de una subunidad a10 de integrina de unión a colágeno, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
14. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende además la etapa (e) de aislar la subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento a partir de dicha célula huésped transformada o medio de cultivo.
15. Heterodímero de integrina aislado o recombinante que comprende una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y una subunidad p.
16. Heterodímero de integrina según la reivindicación 15, en el que la subunidad p es p1.
17. Procedimiento para producir un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16, procedimiento que comprende las etapas de:
(a) aislar un primer polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 y un segundo polinucleótido que codifica para una subunidad p;
(b) construir uno o más vectores de expresión que comprenden los polinucleótidos primero y segundo;
(c) transformar una célula huésped con dicho (s) vector (es) de expresión; y
(d) cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones adecuadas para la expresión de un heterodímero de integrina.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que la subunidad p es p1.
19. Procedimiento según la reivindicación 17 ó 18, que comprende además la etapa (e) de aislar el heterodímero de integrina a partir de dicha célula huésped transformada o medio de cultivo.
20. Célula que comprende un primer vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10 y un segundo vector que comprende un polinucleótido que codifica para una subunidad p.
21. Célula según la reivindicación 20, en la que la subunidad p es p1.
22. Entidad de unión que tiene la capacidad de unirse específicamente a la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID no. 1, o a una variante de corte y empalme de la misma mostrada en SEQ ID no. 2, o a un fragmento de la misma
en la que:
el fragmento se selecciona del grupo que consiste en fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos KLGFFAHKKIPEEEKREEKLEQ, fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 952 hasta el aminoácido n.º 986 de SEQ ID no. 1 y fragmentos que consisten en la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido n.º 140 hasta el aminoácido n.º 337 de SEQ ID no. 1, y siendo la entidad de unión un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo.
23. Entidad de unión según la reivindicación 22, en la que el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.
24. Composición farmacéutica que comprende una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 o una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23.
25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, siendo la composición una composición de vacuna.
26. Subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su uso en medicina.
27. Polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, para su uso en medicina.
28. Heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16, para su uso en medicina.
29. Entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23, para su uso en medicina.
30. Uso de una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 o una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 en la preparación de un agente de diagnóstico para detectar células o tejidos que expresan dicha subunidad a10 de integrina.
31. Uso de una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 en la preparación de un medicamento para seleccionar como diana moléculas de células o tejidos durante estados patológicos que comprenden daño de cartílago, traumatismo, cáncer, artritis reumatoide, inflamación u osteoartritis.
32. Uso según la reivindicación 30, en el que el agente de diagnóstico comprende una composición farmacéutica según la reivindicación 24 ó 25.
33. Uso según la reivindicación 30 ó 31, en el que las células se seleccionan del grupo que consiste en condrocitos, células de músculo liso, células endoteliales, osteoblastos y fibroblastos.
34. Uso según la reivindicación 30, para determinar el estado de diferenciación de las células.
35. Uso de una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 in vitro para detectar la formación de cartílago.
36. Uso de una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 in vitro para determinar el estado de diferenciación de las células.
37. Uso de una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 o una entidad de unión según la reivindicación 22 ó 23 in vitro para selección, análisis, clasificación, aislamiento o purificación de condrocitos.
38. Uso de una subunidad a10 de integrina, variante de corte y empalme o fragmento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o un heterodímero de integrina según la reivindicación 15 ó 16 in vitro para identificar entidades que se unen a dicha subunidad a10 de integrina.
39. Método para estimular, inhibir o bloquear la formación de cartílago o hueso in 10 vitro que comprende tratamiento con una entidad de unión según la reivindicación 22 ó
23.
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