Enzima de fosforilación de un fármaco.

Un procedimiento de detección selectiva de una sustancia fosforilada por la FN3KRP humana y/o la FN3Khumana,

que comprende las etapas siguientes (1) a (3):

(1) poner en contacto una sustancia de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste enlos siguientes (a) a (c):

(a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos nº 1-309 de la SEC ID Nº2 en el listado de secuencias:

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos nº 1-309 de la SEC ID Nº4 en el listado de secuencias; y

(c ) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción, sustitución oadición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptidoseleccionado del anterior (a) y (b) y que tiene la capacidad de fosforilar el (2R)-2-amino-2-metil-4-[5-(5-fenilpentanoil)tiofen-2-il]butan-1-ol;

(2) medir la cantidad de éster fosfórico de la sustancia de ensayo generada; y

(3) comparar la cantidad del éster fosfórico generado medida en (2) anteriormente con la cantidad del ésterfosfórico de la sustancia de ensayo medida cuando la sustancia de ensayo no está en contacto con elpolipéptido seleccionado de los anteriores (a) a (c).

que se caracteriza porque la sustancia de ensayo es un compuesto representado por la fórmula general (I)siguiente:

en la que cada uno de R1 y R2 representa un átomo de hidrógeno; R3 representa un grupo alquilo C1-C6 o ungrupo hidroximetilo; R4 representa un átomo de hidrógeno; un átomo de halógeno o un grupo alquilo C1-C6; R5representa un grupo fenilo, un grupo fenilo que está sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados delgrupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C1-C6, un grupo alcoxi C1-C6,un grupo cicloalquilo C3-C6, un grupo halógeno alquilo C1-C6, un grupo fenilo y un grupo benciloxi, un átomode halógeno o un átomo de hidrógeno; X representa un grupo vinileno (grupo CH≥CH), un átomo de oxígeno,un átomo de azufre o un grupo metilamino; Y representa un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo deazufre o un grupo carbonilo; Z representa un enlace sencillo o un grupo alquileno C1-C8; y n es 2 o 3, con lacondición de que Z no puede representan un enlace sencillo cuando Y representa un enlace sencillo.

Enzima de fosforilación de un fármaco

Campo de la técnica La presente invención se refiere a una enzima que fosforila un fármaco en el cuerpo vivo. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento de detección selectiva de un compuesto fosforilado mediante la enzima mencionada anteriormente, un procedimiento de determinar la capacidad de un sujeto para fosforilar un compuesto de ensayo, etc.

Técnica anterior

Algunos productos farmacéuticos en la etapa de ser administrados a pacientes tienen una estructura diferente de la de un compuesto que tiene una eficacia farmacológica real. Después de administrar dichos productos farmacéuticos a un paciente, estos se metabolizan en el cuerpo vivo. Como resultado su estructura varía y exhiben su eficacia farmacológica en ese momento. Dicho compuesto antes de metabolizarse en el cuerpo vivo se denomina profármaco. Se han conocido varios tipos de enzimas que metabolizan un profármaco en un compuesto que tiene eficacia farmacológica.

Algunos derivados de aminoalcohol están fosforilados in vivo y, como resultado, exhiben actividad inmunosupresora. Por ejemplo, FTY720 (clorhidrato de 2-Amino-2-[2- (4-octilfenil) etil]propano-1, 3-diol) se fosforila in vivo por la acción de la esfingosina quinasa 1 y 2, de modo que se convierte en FTY720-fosfato [es decir, (:) 2-amino-2 fosforiloximetil4- (4-octilfenil) butanol] que exhibe acción inmunosupresora (The Journal of Biological Chemistr y , (2003) , 278, pág. 47408-47415) .

Por otro lado, también se considera que un compuesto representado por la fórmula general (I) (en la que cada uno de R1 y R2 representa un átomo de hidrógeno; R3 representa un grupo alquilo C1-C6 o un grupo hidroximetilo; R4 representa un átomo de hidrógeno; un átomo de halógeno o un grupo alquilo C1-C6; R5 representa un grupo fenilo, que está sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados del grupo que consiste en un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C1-C6, un grupo alcoxi C1-C6, un grupo cicloalquilo C3-C6, un grupo halógeno alquilo C1-C6, un grupo fenilo y un grupo benciloxi, un átomo de halógeno o un átomo de hidrógeno; X representa un grupo vinileno (grupo CH=CH) , un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo metilamino; Y representa un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo carbonilo; Z represente un enlace sencillo o un grupo alquileno C1-C8; y n es 2 o 3) está fosforilado in vivo, de modo que se puede convertir en una forma activa que exhibe actividad inmunosupresora (patente japonesa abierta a consulta por el público nº 2005

46141.) No obstante, el mecanismo de esta fosforilación in vivo es desconocido.

La elucidación del mecanismo de fosforilación de dichos compuestos se ha considerado eficaz para la búsqueda de compuestos que se activan siendo fosforilados in vivo, para aclaración del mecanismo de expresión de actividad, para selección de un paciente que es sensible a un fármaco, etc.

Diabetes, (2000) , 49, pág.1627-1634 y Diabetes, (2001) , 50, pág. 2139-2147 comunican la fosforilación mediante la fructosamina-3-quinasa humana de 1-desoxi-1-morfolinofructosa (DMF, una fructosamina sintética) y otros sustratos, tales como fructosalisina y fructosaglicina.

Se ha notificado que una proteína fructosamina-3-quinasa humana relacionada (que en lo sucesivo también se denomina “FN3KRP humana") tiene actividad de fosforilación de la posición 3 de las quetosaminas tal como ribulosamina o psicosamina ( Diabetes, (2003) , 52, pág. 2888-2895) . No obstante, se desconoce el papel de dicha proteína relacionada con la fructosamina-3-quinasa humana in vivo.

Se ha notificado en Biochem J. (2004) , 382, p137-143 que la FN3KRP presente en los eritrocitos puede fosforilar las 45 ribulosaminas y las psicosaminas intracelulares unidas a proteína.

Como resultado de estudios intensivos dirigidos hacia la aclaración del mecanismo de fosforilación del mismo in vivo, el presente inventor ha descubierto que la proteína conocida como FN3KRP humana o fructosamina-3-quinasa humana (que en lo sucesivo en el presente documento también se denomina “FN3K humana”) se asocia con la fosforilación del compuesto representado por la fórmula general (I) mencionada anteriormente, de modo que se completa la presente invención.

Es un objeto de la presente invención aclarar una enzima que fosforila in vivo el compuesto representado por la fórmula general (I) mencionada anteriormente, tal como (2R) -2-amino-2-metil-4-[5- (5-fenilpentanoil) tiofen-2-il]butan1-ol. Además, es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de fosforilar el compuesto mencionado anteriormente usando una enzima que lo fosforila. Además, es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de detección selectiva de un compuesto fosforilado mediante la enzima mencionada anteriormente. Además, es otro objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento de determinar la capacidad de un sujeto para fosforilar un compuesto de ensayo.

Divulgación de la invención Problemas que ha de resolver la invención Como resultado de estudios intensivos dirigidos a conseguir los objetos mencionados anteriormente, los presentes inventores han descubierto que una enzima que fosforila el compuesto representado por la fórmula general (I)

mencionada anteriormente, tal como (2R) -2-amino-2-metil-4-[5- (5-fenilpentanoil) tiofen-2-il]butan-1-ol, es la proteína conocida como proteína relacionada con fructosamina-3-quinasa (que en lo sucesivo también se denomina “"FN3KRP") y/o fructosamina-3-quinasa (que en lo sucesivo también se denomina "FN3K") , completando de este modo la presente invención.

Medios para resolver los problemas Es decir, la presente invención tiene las siguientes características [1] a [9].

[1] Un procedimiento de detección selectiva de una sustancia fosforilada por la FN3KRP humana y/o la FN3K humana, que comprende las etapas siguientes (1) a (3) :

(a) poner en contacto una sustancia de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c) :

(i) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos nº 1-309 de la SEC ID Nº 2 en el listado de secuencias:

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos nº 1-309 de la SEC ID Nº 4 en el listado de secuencias; y

(c ) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción,

sustitución o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido seleccionado del anterior (a) y (b) y que tiene la capacidad de fosforilar el (2R) -2amino-2-metil-4-[5- (5-fenilpentanoil) tiofen-2-il]butan-1-ol;

(2) medir la cantidad de éster fosfórico de la sustancia de ensayo generada; y

(3) comparar la cantidad del éster fosfórico generado medida en (2) anteriormente con la cantidad del

éster fosfórico de la sustancia de ensayo medida cuando la sustancia de ensayo no está en contacto con el polipéptido seleccionado de los anteriores (a) a (c) ) .

que se caracteriza porque la sustancia de ensayo es un compuesto representado por la fórmula general (I) siguiente:

en la que cada uno de R1 y R2 representa un átomo de hidrógeno; R3 representa un grupo alquilo C1-C6 o un grupo hidroximetilo; R4 representa un átomo de hidrógeno; un átomo de halógeno o un grupo alquilo C1-C6; R5 representa un grupo fenilo, un grupo fenilo que está sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados del 45 grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C1-C6, un grupo alcoxi C1-C6, un grupo cicloalquilo C3-C6, un grupo halógeno alquilo C1-C6, un grupo fenilo y un grupo benciloxi, un átomo de halógeno o un átomo de hidrógeno; X representa un grupo vinileno (grupo CH=CH) , un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo metilamino; Y representa un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo de azufre o un grupo carbonilo; Z representa un enlace sencillo o un grupo alquileno C1-C8; y n es 2 o 3, con la condición de que Z no puede representan un enlace sencillo cuando Y representa un enlace sencillo.

[2] Un procedimiento de acuerdo con [1] en lo que antecede, que además comprende la etapa:

(4) determinar que la sustancia de ensayo se ha fosforilado, cuando la cantidad del éster fosfórico medida en (2) anteriormente es mayor en comparación con la cantidad del éster fosfórico de la sustancia de ensayo cuando la sustancia de ensayo no está en contacto con el polipéptido seleccionado de los anteriores (a)... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección selectiva de una sustancia fosforilada por la FN3KRP humana y/o la FN3K humana, que comprende las etapas siguientes (1) a (3) :

(1) poner en contacto una sustancia de ensayo con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en 5 los siguientes (a) a (c) :

(a) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos nº 1-309 de la SEC ID Nº 2 en el listado de secuencias:

(b) un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos nº 1-309 de la SEC ID Nº 4 en el listado de secuencias; y

(c ) un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que comprende una deleción, sustitución o adición de uno o varios aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de un polipéptido seleccionado del anterior (a) y (b) y que tiene la capacidad de fosforilar el (2R) -2-amino-2-metil-4-[5- (5fenilpentanoil) tiofen-2-il]butan-1-ol;

(2) medir la cantidad de éster fosfórico de la sustancia de ensayo generada; y

(3) comparar la cantidad del éster fosfórico generado medida en (2) anteriormente con la cantidad del éster fosfórico de la sustancia de ensayo medida cuando la sustancia de ensayo no está en contacto con el polipéptido seleccionado de los anteriores (a) a (c) .

que se caracteriza porque la sustancia de ensayo es un compuesto representado por la fórmula general (I) siguiente:

en la que cada uno de R1 y R2 representa un átomo de hidrógeno; R3 representa un grupo alquilo C1-C6 o un grupo hidroximetilo; R4 representa un átomo de hidrógeno; un átomo de halógeno o un grupo alquilo C1-C6; R5 25 representa un grupo fenilo, un grupo fenilo que está sustituido con de 1 a 3 sustituyentes seleccionados del

grupo que consiste en un átomo de halógeno, un grupo ciano, un grupo alquilo C1-C6, un grupo alcoxi C1-C6,

un grupo cicloalquilo C3-C6, un grupo halógeno alquilo C1-C6, un grupo fenilo y un grupo benciloxi, un átomo de halógeno o un átomo de hidrógeno; X representa un grupo vinileno (grupo CH=CH) , un átomo de oxígeno,

un átomo de azufre o un grupo metilamino; Y representa un enlace sencillo, un átomo de oxígeno, un átomo de 30 azufre o un grupo carbonilo; Z representa un enlace sencillo o un grupo alquileno C1-C8; y n es 2 o 3, con la condición de que Z no puede representan un enlace sencillo cuando Y representa un enlace sencillo.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, que además comprende la etapa:

(4) determinar que la sustancia de ensayo ha sido fosforilada, cuando la cantidad del éster fosfórico medida en (2) anteriormente es mayor en comparación con la cantidad del éster fosfórico de la sustancia de ensayo 35 medida cuando la sustancia de ensayo no está en contacto con el polipéptido seleccionado de los anteriores (a) a (c) .

3. Un procedimiento de producción de un éster fosfórico, que comprende las etapas siguientes (1) y (2) :

(1) poner en contacto el compuesto representado por la fórmula general (I) como se ha definido en la reivindicación 1 con un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en de (a) a (c) como se ha definido 40 en la reivindicación 1; y

(2) obtener el éster fosfórico del compuesto representado por la fórmula general (I) de la solución de reacción en (1) anterior.

4. Un procedimiento de determinar la capacidad de un sujeto para generar el éster fosfórico del compuesto representado por la fórmula general (I) como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende las etapas 45 siguientes (1) a (3) :

(1) extraer el ARN total de una muestra obtenida de un sujeto;

(2) medir el nivel de expresión de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c) en el ARN total:

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos Nº 6-935 de la SEC ID Nº 1 en el listado de secuencias:

(b) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos N.

2. 956 de la SEC ID Nº 3 en el listado de secuencias; y

(c) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en (a) o (b) anterior, y que codifica un polipéptido que tiene la capacidad para fosforilar in vivo el compuesto representado por la fórmula general (I) ; y

(3) comparar el nivel de expresión del polinucleótido medido en (2) anterior con el nivel de expresión del dicho polinucleótido en una muestra que se ha confirmado que tiene la capacidad para fosforilar in vivo el compuesto representado por la fórmula general (I) , para examinar la capacidad del sujeto para fosforilar el compuesto representado por la fórmula general (I) .

5. Un procedimiento de determinar la capacidad de un paciente para generar el éster fosfórico del compuesto representado por la fórmula general (I) como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes (1) y (2) :

(1) medir el nivel de expresión de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en de (a) a (c) como se ha definido en la reivindicación 1 en una muestra obtenida de un sujeto; y

(2) comparar el nivel de expresión del polipéptido en (1) anterior con el nivel de expresión de dicho polipéptido en una muestra que se ha confirmado que tiene la capacidad para fosforilar in vivo el compuesto representado por la fórmula general (I) , para examinar la capacidad del sujeto para fosforilar el compuesto representado por la fórmula general (I) .

6. Un procedimiento de determinar la capacidad de un paciente para generar el éster fosfórico del compuesto representado por la fórmula general (I) como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes (1) y (2) :

(1) medir la actividad enzimática de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en de (a) a (c) como se ha definido en la reivindicación 1 en una muestra obtenida de un sujeto; y

(2) comparar la actividad enzimática del polipéptido en (1) anterior con la actividad enzimática de dicho polipéptido en una muestra que se ha confirmado que tiene la capacidad para fosforilar in vivo el compuesto representado por la fórmula general (I) , para examinar la capacidad del sujeto para fosforilar el compuesto representado por la fórmula general (I) .

7. Un procedimiento de determinar la capacidad de un sujeto para generar el éster fosfórico del compuesto representado por la fórmula general (I) como se ha definido en la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes (1) a (3) :

(1) examinar la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (a) a (c) en una muestra obtenida de un sujeto:

(a) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos Nº 1-1466 de la SEC ID Nº 1 en el listado de secuencias:

(b) un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos que consiste en los nucleótidos Nº 1-1781 de la SEC ID Nº 3 en el listado de secuencias; y

(c) un polinucleótido que hibrida en condiciones rigurosas con un polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos complementaria a la secuencia de nucleótidos descrita en (a) o (b) anterior, y que codifica un polipéptido que tiene la capacidad para fosforilar in vivo el compuesto representado por la fórmula general (I) ;

(2) examinar la presencia o ausencia de una mutación en la secuencia de nucleótidos de dicho polinucleótido que influye sobre la actividad de la enzima; y

(3) determinar que el sujeto tiene únicamente una capacidad baja para fosforilar el compuesto representado por la fórmula general (I) cuando el sujeto tiene, en la secuencia de nucleótidos, una mutación que disminuye la actividad de fosforilación del polipéptido codificado por dicho polinucleótido descrito anteriormente, y determinar que el sujeto tiene la capacidad para fosforilar el compuesto representado por la

fórmula general (I) cuando el sujeto no tiene en la secuencia de nucleótidos una mutación que disminuye la actividad de fosforilación dicho polipéptido.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, caracterizado porque la muestra es sangre periférica.

9. Uso de un kit que comprende al menos uno seleccionado del grupo que consiste en los siguientes (1) a (5) :

(1) un cebador oligonucleotídico que comprende de 15 a 30 nucleótidos contiguos que se usa para amplificar específicamente una parte de todo el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID Nº 1 o 3 en el listado de secuencias:

(2) una sonda polinucleotídica que comprende 15 o más nucleótidos contiguos que hibrida en condiciones

rigurosas con el polinucleótido que tiene la secuencia de nucleótidos como se muestra en la SEC ID Nº 1 o 3 en el listado de secuencias, para detectar dicho polinucleótido;

(3) una muestra en fase sólida que tiene un polinucleótido seleccionado de entre el cebador oligonucleotídico descrito en (1) anteriormente o la sonda polinucleotídica descrita en (2) anterior inmovilizada en la misma;

(4) un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido seleccionado de (a) a (c) como se define en 15 la reivindicación 1, para detectar la proteína; y

(5) un anticuerpo secundario que se une al anticuerpo descrito en (4) anterior,

para determinar la capacidad para metabolizar un compuesto farmacológico representado por la fórmula general (I) definida en la reivindicación 1.