Construcciones multiméricas.

Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que:

X comprende una porción del receptor de VEGF;

Y es un resto enlazador; y

Z es un dominio de multimerización,

en donde el resto enlazador Y es un polipéptido de 5-50 restos aminoacídicos que tiene una flexibilidad por encimade la media como se determina por el método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz, 1985, Naturwiss, 72:212-213, y donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.

Construcciones multiméricas.

Campo de la invención La invención se refiere a proteínas construidas de forma recombinante útiles para tratar la neovascularizaciónpatológica, por ejemplo, asma, artritis, cáncer, y degeneración macular.

Antecedentes de la invención La neovascularización patológica es un componente clave de enfermedades como degeneración macular relacionada con la edad (AMD) húmeda, retinopatía diabética proliferativa, artritis reumatoide, osteoartritis, y asma. También desempaña un papel importante en el crecimiento y propagación de tumores. La neovascularización estáregulada por un delicado equilibrio de factores pro- y anti-angiogénicos.

Se sabe que el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF) es necesario para la neovascularización. Se ha demostrado que la inhibición de la actividad VEGF inhibe la neovascularización en modelos animales de AMD, artritis y en diversos modelos de tumor. Los métodos usados para inhibir la actividad VEGF incluyen anticuerpos, proteínas de fusión receptoras, péptidos y pequeñas moléculas.

Se ha demostrado que las proteínas VEGF-R1 (Flt-1) y VEGF-R2 (KDR) se unen a VEGF con elevada afinidad. Tanto Flt-1 como KDR tienen siete dominios tipo Ig en su región extracelular. Se ha demostrado que el domino 2 es esencial para la unión a VEGF. Fusiones de cada uno de los receptores solubles de longitud completa (dominios 17) y los dominios 1-3 con Fc de IgG se unen a VEGF de forma eficaz. Las fusiones de Fc de IgG con el dominio tipoIg 2 solo, sin embargo, eran incapaces de unirse a VEGF, ya que eran una combinación de dominio tipo Ig 1 y 2.Davis-Smyth, 1996. Por lo tanto, los dominios tipo Ig 1 y 3 parecen ser necesarios junto con el dominio 2 para launión eficaz a VEGF.

Holash et al. (Proceedings of the National Academy of Science, vol. 99 (17) : 11393-11398 (2002) ) describepolipéptidos de fusión adicionales que comprenden partes del receptor de VEGF-R1 fusionadas a la parte Fc de lacadena pesada de IgG1.

WO 00/75319 describe polipéptidos que son receptores Flt1 quiméricos modificados y se dice que tienen un perfilfarmacocinético mejorado.

WO 97/44453 describe proteínas que son receptores quiméricos de VEGF y se dice que se unen a VEGF y queantagonizan su actividad angiogénica y proliferativa de las células endoteliales.

Olafsen et al. (Protein Engineering, Design & Selection, v. 17 (4) , p. 315-323 (2004) ) describe la caracterización defragmentos de anticuerpos anti-p185HER-2 (scFv-CH3) 2 construidos por ingeniería genética.

Hu et al. (Cancer Research, v. 56 (13) , p. 3055-3061 (1996) ) describe un fragmento de anticuerpo anti-antígenocarcinoembrionario (scFv-CH3) construido por ingeniería genética y se dice que presenta focalización rápida y precisa de xenoinjertos.

Breve sumario de la invención De acuerdo con un aspecto de la presente descripción, se proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusióntiene la fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptorextracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y constaesencialmente de un polipéptido de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadenapesada de IgG.

Otro aspecto de la presente descripción es un polipéptido de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador queproporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG.

Otro aspecto más de la presente descripción es una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restosaminoacídicos. Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

La presente descripción también proporciona una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z. X comprende un polipéptidoseleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador queproporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una parte Fc de una molécula de anticuerpo.

Otro aspecto más de la presente descripción es un método para multimerizar un polipéptido X. Un polipéptido X seune a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar el polipéptido XYZ. X comprende un polipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, unacitoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un polipéptido de 5-25 restosaminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que se forma semultimeriza.

Otro aspecto más de la presente descripción proporciona un método para multimerizar un polipéptido X. Elpolipéptido X se une a un polipéptido Z mediante un resto Y para formar el polímero XYZ. X comprende unpolipéptido seleccionado entre el grupo compuesto por un receptor extracelular, una región variable de anticuerpo, una citoquina, una quimioquina, y un factor de crecimiento. Y consta esencialmente de un resto enlazador queproporciona la separación espacial de 5-25 restos aminoacídicos. Z es una región CH3 de una molécula de cadena pesada de IgG. El polipéptido XYZ que así se forma se multimeriza.

En un aspecto de la presente descripción se proporciona un ácido nucleico. La molécula de ácido nucleico codificauna proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) ; un enlazador; y un dominio demultimerización. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por lasSEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

En otro aspecto de la presente descripción se proporciona una proteína de fusión. La proteína de fusión comprendeun dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) , un enlazador, y un dominio de multimerización. La proteína de fusióncomprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

En otro aspecto de la presente descripción se proporciona un método in vitro. Se suministra una molécula de ácido nucleico a una célula de mamífero aislada. La molécula de ácido nucleico codifica una proteína de fusión quecomprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) ; un enlazador; y un dominio de multimerización. La proteína defusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. Laexpresión de la proteína de fusión está controlada por un promotor. Se forma una célula que expresa una proteínade fusión.

Otro aspecto más de la presente descripción es un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero.Se suministra una célula de mamífero que expresa la proteína de fusión a un mamífero. La célula expresa y secretala proteína de fusión suministrando de este modo la proteína de fusión al mamífero. La proteína de fusión comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) , un enlazador, y un dominio de multimerización. La proteína defusión comprende una secuencia seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25.

Otro aspecto de la presente descripción es un método para suministrar una proteína de fusión a un mamífero. Sesuministra una proteína de fusión que comprende un dominio tipo Ig 2 de VEGF-R1 (Flt-1) , un enlazador, y undominio de multimerización a un mamífero. La proteína de fusión comprende una secuencia seleccionada entre elgrupo compuesto por las SEC ID Nº 2, 8, 21, 23, y 25. Como alternativa, puede suministrarse una construcción deácido nucleico que codifica dicha proteína de fusión al mamífero, por lo cual el mamífero expresa la proteína defusión.

Estos y otros aspectos de la presente descripción que se describirán en más detalle a continuación proporcionan ala técnica métodos y agentes para tratar enfermedades relacionadas con la proliferación e inflamación vascular. Losagentes pueden proporcionar estabilidad y biodisponibilidad aumentadas con relación a las formas naturales de lasproteínas.

Ahora una parte de la descripción que está contenida en este documento proporciona los aspectos y realizacionesde la presente invención. Más particularmente, un primer aspecto... [Seguir leyendo]

1. Una proteína de fusión de fórmula X-Y-Z, en la que: X comprende una porción del receptor de VEGF; Y es un resto enlazador; y Z es un dominio de multimerización, en donde el resto enlazador Y es un polipéptido de 5-50 restos aminoacídicos que tiene una flexibilidad por encima

de la media como se determina por el método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz, 1985, Naturwiss, 72.

21. 213, y donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.

2. La proteína de fusión de la reivindicación 1, en la que el resto enlazador Y se selecciona entre el grupo compuesto por Gly9 (SEC ID Nº 27) , Glu9 (SEC ID Nº 28) , Ser9 (SEC ID Nº 29) , Gly5CysPro2Cys (SEC ID Nº 30) , (Gly4Ser) 3 (SEC ID Nº 31) , SerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 32) , Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn (SEC ID Nº 13) ,

Gly-Asp-Leu-Ile-Tyr-Arg-Asn-Gln-Lys (SEC ID Nº 26) , y Gly9ProSerCysValProLeuMetArgCysGlyGlyCysCysAsn (SEC ID Nº 34) .

3. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio de multimerización Z causa la migración de al menos 50% de las proteínas de fusión monoméricas en un gel de poliacrilamida nodesnaturalizante a una velocidad que es apropiada para un multímero de la proteína de fusión.

4. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio de multimerización Z es un fragmento de una cadena pesada de IgG.

5. La proteína de fusión de la reivindicación 4, en donde el dominio de multimerización Z es una secuencia de una porción de Fc de una cadena pesada de IgG1 o IgG2.

6. La proteína de fusión de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el dominio de multimerización Z es una región CH3 de una cadena pesada de IgG o es una porción de Fc de una molécula de anticuerpo.

7. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde X comprende el dominio 2 de tipoIgG de VEGF-R1.

8. La proteína de fusión de la reivindicación 7, en donde X comprende el dominio 2 de tipo IgG de VEGF-R1 pero carece de los dominios 1 y 3 de tipo Ig de VEGF-R1.

9. La proteína de fusión de la reivindicación 8, en donde X es el dominio 2 de tipo IgG de VEGF-R1.

10. Una composición que comprende la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables.

11. Un método para multimerizar un polipéptido X, comprendiendo el método unir el polipéptido X a un polipéptido Z mediante un polipéptido Y para formar un polipéptido X-Y-Z, en donde:

X comprende una porción de un receptor de VEGF; Y es un resto enlazador; yZ es un dominio de multimerización, en donde el resto enlazador Y es un polipéptido d.

5. 50 restos aminoacídicos que tiene una flexibilidad por encima de la media como se determina por el método de predicción de flexibilidad de Karpus y Schultz, 1985, Naturwiss, 72.

21. 213, y donde dicha proteína de fusión se une a VEGF cuando se multimeriza.

12. El método de la reivindicación 11, en donde la etapa de unión comprende construir una molécula de ácidonucleico que codifica los polipéptidos X, Y y Z como un solo marco de lectura abierto, en donde dicho polipéptido X-Y-Z es expresado a partir de dicha molécula de ácido nucleico en una célula hospedante.

13. Una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

9.

14. La molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13, que codifica una proteína de fusión de la reivindicación 1, en donde la proteína de fusión comprende una secuencia que se selecciona del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 8, 21, 23 y 25.

15. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14.

16. El vector de la reivindicación 15, en donde el vector es un vector viral adeno-asociado.

17. Una célula de mamífero que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14 o el vector de 10 la reivindicación 15 o 16.

18. Un método in vitro que comprende suministrar el ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14 o el vector de las reivindicaciones 15 o 16 a una célula de mamífero para producir una célula que expresa dicha proteína de fusión.

19. La proteína de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 13 o 14, el vector de la reivindicación 15 o 16, o la célula de mamífero de la reivindicación 17, para uso en el tratamiento de un mamífero.

20. La proteína de fusión, molécula de ácido nucleico, vector o célula de mamífero para uso según la reivindicación 19, en donde el mamífero tiene degeneración macular húmeda relacionada con la edad, retinopatía diabética proliferativa, cáncer, artritis reumatoide, asma, u osteoartritis.